免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(酶、荧光素、金属离子、同位素)显色来确定组织、细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry,ICC).

一、标本制备
    石蜡切片：组织取材、固定、包埋,切片(一般的组织化学染色切片厚度要求5～7 µm,常规病理切片2～3 µm)

二、实验试剂
    PBS、柠檬酸三钠·2H₂O、30%H₂O₂、柠檬酸、山羊血清、第一抗体、第二抗体

三、操作步骤：
1. 石蜡切片60℃预热10～20分钟.
2. 常规脱蜡水合：二甲苯5分钟,2次→无水乙醇5分钟,2次→95％乙醇5分钟,2次→75％乙醇5分钟1次→ddH2O 5分钟1次.
3. PBS洗 3次,5分钟/次.
4. 抗原修复：用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)于微波炉(750W煮沸3分钟,90W11.5分钟)修复后,组织切片自然晾至室温.
5. 封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2室温湿盒孵育10分钟.
6. PBS洗 3次,5分钟/次.
7. 正常山羊血清室温湿盒封闭30分钟.
8. 一抗孵育：将组织切片于稀释的一抗溶液中4℃湿盒孵育过夜.
9. 室温复温15分钟.
10. PBS洗 3次,5分钟/次.
11. 二抗室温湿盒孵育30～60分钟.
12. PBS洗 3次,5分钟/次.
13. DAB显色,室温1～10分钟,显微镜下掌控.
14. ddH2O洗 3次,5分钟/次.
15. 苏木素复染1～10分钟,1％盐酸酒精分化,显微镜下掌控.
16. 脱水：95％乙醇2次,10分钟/次→无水乙醇2次,10分钟/次.
17. 透明：二甲苯2次,10分钟/次.
18. 性树胶封片

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