免疫荧光组织(细胞)化学技术是采用荧光素标记的已知抗体 (或抗原)作为探针,检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体),形成的抗原抗体复合物上带有荧光素,在荧光显微镜下,由于受紫外光照射,荧光素发出明亮的荧光,这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质,并可利用荧光定量技术计算抗原的含量,以达到对抗原物质定位、定性、半定量测定的目的.
    常用的荧光染料有：
① 异硫氰酸荧光素(fluorecein isothiocyante,FITC),为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末,有两种异构体,易溶于水和酒精等溶剂.分子量为389,最大吸收光谱为490～495,最大发射光谱为520～530urn,呈现明亮的黄绿色荧光,是最常用的标记抗体的荧光素.
② 四甲基异氰酸罗丹明(tetrametrylrhodarnine isothiocyante,TRITC)是一种紫红色粉末,较稳定,是罗达明(rhodamine)的衍生物.最大吸收光谱550urn,最大发射光谱620urn,呈橙红色荧光,与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明,常用于双标记染色.
    免疫荧光法可分为直接法和间接法两种.下面以间接法为例,实验操作步骤如下：
1  将细胞种于干净盖玻片上.
2  PBS洗细胞3次,5分钟/次.
3  冰甲醇︱丙酮(体积1：1)–20℃ 10分钟
4  PBS洗 3次,5分钟/次.
5  0.1%Triton X-100/0.1%柠檬酸三钠溶液破膜,室温10分钟.
6  0.5%Tween 20-PBS洗3次,2分钟/次.
7  正常山羊血清室温湿盒封闭30分钟.
8  一抗湿盒37℃孵育1小时或4℃孵育过夜.
9  室温复温15分钟.
10  0.5%Tween 20-PBS洗3次,2分钟/次.
11  二抗室温湿盒30分钟,避光.
12  0.5%Tween 20-PBS洗2次,2分钟/次.
13  Hoechst或DAPI复染核,室温20分钟,避光.
14  0.5%Tween 20-PBS洗3次,2分钟/次,避光.
15  缓冲甘油封片,拍照.

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