一、细胞培养所用玻璃及塑料 制品的清洗与消毒
1、清洗
    在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长,如微生物产品附带杂物、上次细胞残留物、非营养成分的化学物质.
    需要清洗的培养用品有,玻璃器皿的清洗、胶塞的清洗、塑料制品的清洗

玻璃器皿的清洗：
    包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤,清洗后的玻璃器皿,干净透明无油迹,不能残留任何物质.
    浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附着物软化或被溶掉.新的初次使用的玻璃器皿,在生产及运输过程中,玻璃表面带有大量的干固的灰尘,且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等,先用自来水简单刷洗,然后用5％稀盐酸液浸泡过夜,以中和其中的碱性物质,再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质,干固后不易洗掉,用后立即浸入水中,要求完全浸入,不能留有气泡或浮在液面上.
    刷洗： 用毛刷沾洗涤剂刷洗,以除去器皿表面附着较牢的杂质,刷洗要适度,过度会损害器皿表面光泽度.
    浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中,清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用,而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质,浸泡时器皿要充满清洁液,勿留气泡或器皿露出清洁液面,浸泡时间一般为过夜,不应少于6 小时.
    清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）
    强清洁液  63∶1000∶200
    次强清洗液 120∶ 200∶1000
    弱清洁液   100∶ 100∶1000
    配制时应注意安全,须穿戴耐酸手套和围裙,并要保护好面部及身体裸露部分,配制过程中可使重铬酸钾溶于水中,然后慢慢加浓硫酸.并不停的用玻璃棒搅拌,使产生的热量挥发,配制溶液应选择塑料制品,配成后清洁液一般为棕红色.
    冲洗在使用后,刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗.使之尽量不留污染或清洁液的残迹,
    需流水冲洗十次以上,每次水须灌满及倒干净,最好用蒸馏水清洗3-5 次,晾干备用.

胶塞的清洗
    新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质,应先用自来水冲洗,再做常规处理,常规清洗方法,每次用后立即置入水中浸泡,用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质）,自来水冲洗,蒸馏水冲洗2-3次,晾干备用.

塑料制品的清洗
    塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装,打开包装即可用,多为一次性物品,
    必要时用2% NaOH 浸泡过夜,用自来水充分冲洗,再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟,最后用自来水和蒸馏水冲洗干净,晾干备用.
    消毒：细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染.常见原因：操作间或周围空间的不洁、培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底、由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败,故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规,防止发生污染.

 
消毒灭菌方法
1）、物理消毒灭菌法
    紫外线：用于空气,操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿,30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃,20min.干烤：160℃, 2 小时；过滤：0.22μm
2）、化学消毒灭菌法
    70%酒精,主要用于操作者的皮肤,操作台表面及无菌室内的壁面处理.
    1‰新洁尔灭,主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒
3）、抗生素,主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染
 
2、细胞培养常用物品
水
水的制备： 
    细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质.需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净
细胞培养基
    市场上可提供干粉培养基和液体培养基,干粉培养基需使用者自己配制并灭菌,其优点是价格便宜.缺点是配制过程繁琐,质量不易控制.液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产,不仅质量得到保证,而且使用十分方便.
常用的培养基种类
    RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、DMEMF/F12、McCoys 5A、M199、F10等
细胞培养基应用选择
    选择培养基没有一定的标准,有几点建议可供参考： 
    (1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基.可以查阅参考文献,或在购买细胞株时咨询. 
    (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试,许多培养基可以适合多种细胞. 
    (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基.如小鼠细胞株多选 RPMI1640 . 
    (4) 用多种培养基培养目的细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、集落形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基,这是最客观的方法,但比较繁琐.
制备1000mlRPMI 1640培养基
    材料：RPMI 1640 干粉培养基10.4g（1包） 蒸馏水 400ml 　　　
    方法：
    1).磁力搅拌至完全溶解  　　　　 
    2).加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下,用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌,并分装成200ml/瓶,-20℃保存备用.
用前取一瓶溶解,每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%,即加22ml.再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml. ------- 细胞培养液
 

血清
    热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清
    热灭活目的：灭活血清中的补体成分.如果不做细胞因子和免疫相关的实验,建议血清不要灭活.
    RPMI 因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,还会影响血清的质量.灭活后严重影响细胞生长速度,且细胞贴壁率降低.
血清中的沉淀物
    絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量.可用离心3000rpm, 5 分钟去除,也可不用处理
显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多.有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染.一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清
平衡盐液体
    组织细胞培养中常用的基本液体,可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分
    用于洗涤组织、细胞等
PBS（Phosphate-Buffered Sallines）
     KCl 0.20g
     KH2PO4  0.20g
     NaCl 8.00g
     Na2HPO4·7H2O 2.16g
DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型
     CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)   0.10g
     KCl            0.20g
     KH2PO4         0.20g
     MgCl2·6H2O    0.10g
     NaCl           8.00g
     Na2HPO4·7H2O  2.16g
D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)
     KCl         0.40g
     KH2PO4      0.06g
     NaCl        8.00g
     NaCO3       0.35g
     Na2HPO4     0.048g
     D-Glucose   1.00g
     Phenol Red  0.01g 
 
消化液
    作用：分离组织和分散细胞
    常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液（单独或混合使用）
    胰蛋白酶溶液
    主要作用：使细胞间的蛋白质水解,使细胞相互离散
    消化细胞时,加入一些血清或含血清的培养液,能终止消化作用
    胰蛋白酶溶液配制
    称取胰蛋白酶粉末置烧杯中,用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状,再补足D-Hanks 平衡盐溶液,搅拌混匀,置室温4 小时或冰箱过夜,不断搅拌振荡
次日,先用滤纸粗滤,再进行过滤除菌,分装入瓶中, -20℃保存备用（以免分解失效）,常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%）
    胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右

pH 调整液
    NaHCO3 溶液
    常用浓度为7.5%.配制时用三蒸水溶解后,过滤除菌或高压灭菌,分装,4℃保存
    HEPES（分子量238.31）溶液
    一种弱酸,中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸,对细胞无毒性.
    主要作用:防止培养基pH迅速变动.在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境,CO2气体迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此时可以维持pH7.0左右.一般在进行克隆化培养时要添加HEPES
    使用终浓度一般为10-50mmol/L.
    常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES,过滤除菌或高压灭菌,分装小瓶,4℃保存.使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液,终浓度为20mmol/L

谷氨酰胺补充液
    谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置7天即可分解约50%,所以都是在使用前添加
    配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入培养液内
    使用终浓度为1-4mmol/L
一般配制为100倍浓缩液,即浓度为200mmol/L（29.22g/L）,配制方法为 ：
    谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后（应加温30℃）,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入    0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液,终浓度为1-4mmol/L


抗生素溶液
    抗生素使用种类与浓度：
                  工作浓度储存温度杀灭细菌 
    penicillin  100 u/ml  -20℃  G(+) 
    streptomycin 100 ug/ml  -20℃  G(+) 、G(-) 
    gentamicin   50 ug/ml   - 20℃  G(+) 、G(-)、支原体 
    amphotericin B  2.5 ug/ml  -20℃   真菌 
    nystatin    50 ug/ml   -20℃   真菌

器材和液体的准备
    细胞培养用的玻璃器材
    培养瓶、吸管等在清洗干净以后,装在铝盒和铁筒中,160℃,2小时干烤灭菌后备用
    手术器材、瓶塞、配制好的PBS液
    15磅,121℃,20分钟蒸气灭菌
    MEM培养液、小牛血清、消化液
    用G6滤器负压抽滤后备用   
 
无菌操作中的注意事项
    在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁
    操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟
    操作时,小心取用无菌之实验物品,避免造成污染.勿碰触吸管尖头部或容器瓶口,亦不要在打 开之容器正上方操作实验.容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用 
    在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行

哺乳动物细胞冷冻保存
冷冻保存要点
    冷冻过程要缓慢.4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存
    冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90％,无微生物污染.细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml.
常用细胞冷冻保存液
    10％DMSO ＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）
    10％甘油＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）


冷冻保存细胞的解冻与复苏要点
快速解冻
    冻存细胞从液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）
    解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养,24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液,以去除DMSO
如果细胞对冷冻保护剂特别敏感
    解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂,然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中

解冻冷冻保存细胞的离心方法
    从液氮中取出冻存的细胞,立即放入37℃水浴中快速解冻
    将1－2ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中,轻轻混匀
    用80g 离心2－3 分钟,弃上清液
    用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团,并计数细胞
    接种细胞到培养瓶中,起始密度为3×105/ml.