1)酵母DNA微量制备(40ml):
1、在125ml三角瓶中用40ml YPD培养液在30℃条件下培养细胞达最大生长量(过夜).
2、将上述培养物移入螺盖离心管,用医用离心机或Sorvall SS－34转头以5000r/min离心5分钟,弃去上清液.
3、将细胞悬浮在3ml的0.9mol/L山梨醇－0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)溶液中.
4、加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T,置37℃条件保温1小时.
5、用医用离心机或Sorvall SS－34转头以5000r/min离心5分钟,弃去上清液.
6、将细胞重新悬浮在5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸钠溶液中.
7、加0.5ml的10％十二烷基硫酸钠(SDS),混匀.
8、置65℃保温30分钟.
9、加1.5ml的5mol/L醋酸钾溶液,在冰浴上放置1小时.
10、用Sorvall SS－34转头以1000r/min离心10分钟.
11、将上清液转移至干净的塑料离心管中,室温下加入两倍体积的95％乙醇,混匀,以5000～6000r/min离心15分钟.</P< p>
12、弃上清液,将沉淀物干燥,然后悬浮在3ml TE缓冲液(pH7.4)中,此操作可能需要几个小时.
13、用Sorvall SS－34转头以1000r/min离心15分钟,将上清液转移到一个新试管,弃沉淀物.
14、加入150μl的1mg/ml RNaseA溶液,在37℃下保温30分钟.
15、加入一倍体积的100％异丙醇,轻轻混匀,取出呈松散纤维状的沉淀物,无需离心,让其自然干燥.
16、将沉淀物悬浮在0.5ml TE缓冲液(pH7.4)中,置4℃保存.酵母DNA的最终浓度约为200μg/ml.如果最后的溶液混浊不清,用异丙醇再次沉淀DNA或用Sorvall SS－34转头以1000r/min离心15分钟.

2)酵母DNA微量制备(5ml):
1、按酵母于5ml YPD中,置30℃培养过夜.
2、用医用离心机以2000r/min离心5分钟沉淀细胞,弃上清液.
3、将细胞悬浮在0.5ml的1mol/L山梨醇－0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)缓冲液中,转动一支1.5ml离心管中.
4、加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液,置37℃保温1小时.
5、离心1小时.
6、弃上清液,把细胞悬浮在0.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2EDTA溶液.</P< p>
7、加0.05ml的10％ SDS,混匀.
8、置65℃保温混合物30分钟.
9、加0.2ml的5mol/L醋酸钾,把离心管在冰浴中放置1小时.
10、离心5分钟.
11、将上清液转移到一洁净微型离心管,室温下加入等体积的无水异丙醇,混匀,放置5分钟.短暂离心(10秒钟)弃上清液,让沉淀自然干燥.
12、用0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮沉淀.
13、加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液,置37℃保温30分钟.
14、加0.03ml的3mol/L醋酸钠,混匀,用0.2ml的无水异丙醇沉淀,再短暂离心收集DNA.
15、弃上清液,自然干燥,用0.1～0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮DNA.
16、在使用限制性内切酶酶解DNA之前,有必要将最终浓度溶液离心较长时间(15分钟)以便除去可能抑制酶解的不溶性物质.


3)10分钟制备酵母DNA方法:
大肠杆菌或酵母转化质粒的制备:
1、在质粒DNA选择性培养基中,置30℃培养少量培养物过夜.
2、将培养物转入一支1.5ml的微型离心管,离心5秒,收集细胞.</P< p>
3、小心倾去上清液,轻弹离心管,使沉淀重新悬浮于残余培养液中.
4、加入0.2ml的2％ Triton X－100,1％SDS,100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8),1mmol/L Na2EDTA;加入0.2ml的苯酚:氯仿:已戊醇(25:24:1);加入0.3g酸洗过的玻珠.
5、振荡2分钟.
6、离心5分钟.
7、用1～5μl含DNA的水相转化0.2ml的大肠杆菌受体菌,用15μl水相转化酵母菌.
用于Southern分析的基因组DNA分离:
1、用YPD培养基,置30℃培养10ml酵母至最大生长量.
2、用医用离心机离心2分钟,弃上清液,收集细胞,用0.5ml蒸馏水重新悬浮,将细胞转入1.5ml微型离心管中,离心5秒收集细胞.
3、重复第二步.
4、重复第二步.
5、加0.2ml TE缓冲液(pH8),振荡3～4分钟.
6、离心5分钟,将水相移至洁净试管,加1ml的无水乙醇,上下倒置,混合均匀.
7、离心2分钟,弃上清液,悬浮在0.4ml TE缓冲液和3μl的10mg/ml的RNase A溶液,置37℃保温5分钟,加入10μl  4mol/L醋酸铵和1ml的无水乙醇,上下倒置,混匀.</P< p>
8、离心2分钟,弃上清液,自然干燥后,用50μl的TE缓冲液悬浮,每份样品用10μl进行Southern印迹分析,每份用量约2～4μg DNA.

4)酵母基因组DNA:玻珠制备法:
1、用5ml培养基在30℃下,摇床培养过夜.
2、转移培养物至13mm×100mm的玻璃离心管中,用台式离心机以1500r/min离心5分钟,收集细胞.
3、用3ml无菌水洗细胞,同上离心.
4、用500μl裂解缓冲液再次悬浮.
5、加入干净玻珠(约1.5ml Eppendorf离心管的2/3体积)和25μl的5mol/L NaCl.
6、以最高速振荡1分钟.
7、用2000r/min离心2分钟.
8、用P-1000移液器转移上清液至一支1.5ml的离心管.
9、加入500μl苯酚,振荡,离心1分钟.用P-1000移液器吸取水相,转移至洁净离心管,加入500μl SEVAG(氯仿:已戊醇,24:1),同上振荡,离心,抽提.</P< p>
10、加入1ml的95％的冷冻乙醇,在-20℃下沉淀1小时.
11、以最高转速离心沉淀DNA,弃上清液,用70％乙醇清洗,最后悬浮在250μl TE缓冲液中.
12、加25μl的EDTA-Sark和5μl的蛋白酶K(10mg/ml),置37℃保温30分钟.
13、加250μl的5mol/L醋酸铵,重复9、10步骤.
14、收集DNA,用70％乙醇洗,悬浮于100μl的TE缓冲液.

相关阅读:
酵母质粒抽提方法
酵母表达纯化
酵母菌落PCR方法
酵母菌的形态观察
酵母表达