关于设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响,至今还没有可靠的规律.虽然我们可以通过对mRNA实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置,但这个过程十分耗时且昂贵,不推荐常规实验使用.一种做法是每个目标序列设计3-4对siRNAs,实验选择较有效的siRNA.

方法一：
    根据Tuschl的实验的设计要点：
    目前,siRNA设计大都根据Tuschl的实验,要点如下：
1、目标基因开放阅读框起始密码下游75至100碱基位置开始,寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列.（用非“AA”的“XY”序列后的19个碱基序列同样可以得到很好效果的siRNA）. 设计siRNA时不要针对5\' 和3\' 端的非编码区.
2、分析获得的序列,选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选.
3、将潜在的序列和相应的基因组数据库（人,或者小鼠,大鼠等等）进行比较,排除和其他编码序列/EST同源的序列.例如使用BLAST等.
4、如果您选择shRNA,有报道显示9个寡核苷酸的环是最有效的.

方法二：
1、从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3\'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点.有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为效.Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5\'和3\'端的非编码区（untranslated regions,UTRs）,原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结 合mRNA从而影响siRNA的效果.
2、将潜在的序列和相应的基因组数据库（人,或者小鼠,大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
3、选出合适的目标序列进行合成.通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列.

负对照：
    一个完整的siRNA实验应该有负对照,作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性.通常的 做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性.如果计划合成siRNA,那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列,厂家会合成一对互补的序列.注意的是通常合成的siRNA是以3\'dTdT结尾,如果要UU结尾的话通常要特别说明.有结果显示,UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别.因为这个突出端无需和靶序列互补.

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