去除 5’ 的磷酸基可防止质粒 DNA 的自身连接和欢呼.在体内连接反应中, DNA 的连接酶可在附近的两个分子间形成磷酸二酯键.但只有当一个分子的 5’ 端带有磷酸基另一分子的 3’ 端带有羟基时,这一反应才能完成.因此,通过用碱性磷酸酶取出线状质粒 DNA 两端磷酸基的方法可最大限度地减少质粒的自身环化.但带有 5’ 端磷酸基的外源 DNA 片段可有效地与去磷酸化的质粒 DNA 连接,形成含有两个缺口的开环分子.由于开环分子的转化效率明显高于去磷酸化的线状 DNA ,理论上大多数转化子应含有重组的质粒.
    尽管有上述理论依据 ,仍有很多研究者对去磷酸化的作用持有疑问.毫无疑问,去除 5’ 端的磷酸基可印制质粒 DNA 的自身环化,因而降低带有 “ 空 ” 质粒的细菌克隆所产生的背景.然而,也会经常发生同时使带有重组质粒的克隆减少的情况.此外,有些研究者认为存在 5’ 端羟基会增加出现重排或缺失克隆的频率.鉴于这些原因,只有载体中有可利用的酶切位点,定向克隆是优先选择的方法.质粒的去磷酸化只在下列情况下被推荐使用：
    将要被克隆的外源 DNA 的量非常之少 . 在这种情况下,用超过外源 DNA10 倍摩尔量的去磷酸化质粒 DNA 才有可能使外源 DNA 连入载体.
    采用限制性内切核酸酶消化微量质粒 DNA 的方法进行转化子的筛选 由于从一批小量细菌培养物中制备质粒很麻烦,采用去磷酸化质粒 DNA 可以保证从少量转化子中获得正确的重组子.
克隆平末端的外源 DNA ：
    如果用两种不同内切酶消化制备的载体产生了大量的转化克隆 这说明或者两种限制酶中的一个对载体的消化不完全,或者从多克隆位点消化下的小片段 DNA 未能从质粒制备物中除净而被连入载体.这两种情况都可以通过采用去磷酸化质粒加以避免,因为去除 5’ 的磷酸基能够防止闭环质粒的重接.
    对于带有互补凸出末端的外源 DNA 片段,而且是采用 α 互补和（或）克隆杂交的方法进行筛选,去磷酸化是不必要的.因为大量的克隆可以很方便地在一块板上进行筛选,即使背景克隆的数目很多,从中挑选出数量不多的重组子也是很容易的事.以下提供的是从线状至理的凸出或平末端除去 5’ 磷酸基的方法.
材料：
    缓冲液和溶液：
        EDTA(0.5mol/L,ph8.0)
        EGTA(0.5mol/L,ph8.0)
    选用,请见步骤 6
        乙醇
        酚
        酚：氯仿（ 1 ： 1 , V/V ）
        SDS(10%,m/V)
        乙酸钠（ 3mol/L , ph5.2 和 PH7.0 ）
        TE （ ph8.0 ）
        Tris-Cl （ 10mmol/L , ph8.3 ）
    酶和缓冲液：
        小牛肠碱性磷酸酶（ CIP ）
        或
        虾碱性磷酸酶（ SAP ）
        蛋白酶 K （ 10mg/ml ）
        限制性内切核酸酶
    凝胶：
        琼脂糖凝胶（ 0.7% ）,用含有 0.5ug/ml 溴化乙锭的 TBE 制备.
        请见步骤 2
    核酸和寡核苷酸：
        载体 DNA （闭环质粒）.
    专用设备：
        可调至 56 ℃ 或 65 ℃ 的水浴.
        请见步骤 6


方法：
1、用 2-3 倍过量的限制酶消化一份合理量（ 10ug ）的闭环盒子里 DNA1h .
2.、取出一小份（ 0.1ug ） DNA, 用含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶（ 0.7% ）电泳检查消化程度,用未消化的质粒 DNA 做对照.如消化不完全,应添加更多的酶继续消化.
3、如已消化完全,用酚：氯仿抽提一次,再用乙醇沉淀回收 DNA .将乙醇溶液置于冰上 15min .
4、于 4 ℃ 用最大转速离心回收 DNA ,用 110ul 10mmol/L Tris-Cl （ ph8.3 ）溶解 DNA .
    保留 20ul 的 DNA 以备以后以后用作对照
5、向余下 90ul 线形 DNA 中加入 10ul 10*CIP 或 10*SAP 缓冲液和适量的小牛肠碱性磷酸酶（ CIP ）或虾碱性磷酸酶（ SAP ）并照附表进行温育.
6、灭活磷酸酶：
    灭活 CIP ：在达到温育时间后,加入 SDS 和 EDTA （ PH8.0 ）使终浓度分辨为 5% 和 5mmol/L, 充分混匀,在加入蛋白酶 K 使终浓度为 100ug/ml, 于 55 ℃ 温育 30min .也可在 5mmol/LEDTA 或 10mmol/LEGTA （两者 PH 均为 8.0 ）存在的条件下于 65 ℃ 温育 30min .
    失活 SAP: 在去磷酸化缓冲液中使反应混合物与 65 ℃ 温育 15min .
    去磷酸化反应结束后,在进行连接反应前取出或使碱性磷酸酶完全失活是非常重要的.尽管 CIP 或 SAP 都可通过上述方法失活,但我们仍然简易在使用去磷酸化的 DNA 进行连接之前最好用酚：氯仿抽提以下去磷酸化反应的混合物.
7、使反应混合物冷至室温,而后用酚抽提一次,再用酚：氯仿抽提一次.
8、用乙醇沉淀法回收 DNA .再次混匀溶液,置于冰上 15min .
9、用 4 ℃ 用最大转速离心回收 DNA ,用 70% 乙醇洗涤沉淀,于 4 ℃ 在此离心.
10、小心弃去上清液,将开盖的离心管置于工作台直至乙醇蒸发殆尽.
11、用 TE （ ph8.0 ）溶解沉淀的 DNA 使浓度为 100ug/ml. 以小份分装 DNA 于 -20 ℃ 保存.
    附表 使DNA5’ 端磷酸基去磷酸化的反应条件
    末端类型 每摩尔 DNA 末端的酶的用量 失活的温度和时间
    5’ 凸出末端 0.01 单位 CIPα 37 ℃ /30min
    0.1 单位 SAP 37 ℃ /60min
    3’ 凸出末端 0.1-0.5 单位 CIPΒ 37 ℃ /15min
而后
    55 ℃ /45min
    0.5 单位 SAP 37 ℃ /60min
    平末端 0.1-0.5 单位 CIPΒ 37 ℃ /15min
而后
    55 ℃ /45min
    0.2 单位 SAP 37 ℃ /60min
    α 在温育第一次 30min 后,再添加一份酶,于 37 ℃ 继续温育 30min .
    β 在 55 ℃ 温育之前再添加一份酶.