摘要 ：从雄性初断乳 SD 大鼠肝匀浆中提取肝刺激因子 (HSS) 并加以部分纯化 , 观察其促人肝癌细胞增殖活性及对 p21ras 蛋白表达的影响.结果表明 : (1) HSS 具有明显的促人肝癌细胞增殖活性 , 其分子量为 14 ～ 20 kD; (2) HSS 可提高 p21ras 蛋白表达 , 具有时间 - 效应关系 , 并与 EGF 呈协同作用 ; (3)HSS 调节 p21ras 蛋白表达具有剂量 - 效应关系 , 且呈现出饱和性.鉴于我们已报道 HSS 上调 EGF 受体蛋白和基因表达这一事实 , 本实验结果进一步说明 , HSS 促人肝癌肝细胞增殖与其调节 EGF 受体介导的信号分子传导过程相关.
    关键词 ：肝刺激因子； p21ras ；肝脏再生
    Abstract:The hepatic stimulator substance (HSS) was partially purified from schedule-lighted weanling rat livers. The effects of HSS on p21ras expression of human hepatic carcinoma cell BEL-7402 were examined. The results showed: (1) HSS was capable of promoting the proliferation of the cells, and its molecular weight was 14 ～ 20 kD; (2) the p21ras expression was increased under HSS effect time-dependently, and the effect of HSS appeared synergistic with EGF; (3) the p21ras expression induced by HSS manifested a dose-dependent manner, and the saturation effect of HSS occurred at the concentration of 100 %26mu;g/ml. Considering together with our previous report about HSS regulation on EGF receptor, these results strongly suggest that the proliferatory effect of HSS on hepatic carcinoma cells is presumedly related with EGF receptor-mediated signal transduction.
    Key words : hepatic stimulator substance; p21ras; liver regeneration
    肝脏具有强大的再生能力.肝再生是在多因素参与下精确有序的调节过程［ 1 ～ 3 ］ .表皮生长因子 (EGF) 、转化生长因子 %26alpha; (TGF-%26alpha;) 、肝细胞生长因子 (HGF) 、胰岛素等均具有显著的促进肝细胞增殖的作用.然而 , 这些生长因子不具有组织特异性 , 因此仅从这些因子出发难以阐明肝再生调节的分子机制. LaBrecque 于 1975 年首先从初断乳大鼠肝中提取肝再生刺激因子 (hepatic regenerative stimulatory substance, HRSS ［ 4 ］ , 后称 HSS), 继而研究了 HSS 的理化特征［ 5 ～ 8 ］ . HSS 可刺激肝细胞 DNA 合成 , 促进肝细胞由 G1 期进入 S 期［ 9 ］ ; 稳定细胞膜 , 减轻 CCl4 和半乳糖胺对肝细胞的毒性作用［ 10,11 ］ .体外研究证明 , HSS 确为人胎肝细胞基因表达产物［ 12 ］ .尽管人们一直努力将 HSS 制成纯品［ 7, 13 ］ , 但未见成功报道.鉴于 HSS 能增强 EGF 促肝细胞增殖活性 , 近年来也有人将 HSS 称之为肝再生增强因子 (augmentor of liver regeneration, ALR) ［ 14 ］ . HSS 是否与已克隆出的 ALR 同为一体 , 尚不能最终定论. 我们曾报道 , HSS 促肝细胞增殖活性与 EGF 受体表达相关［ 15,16 ］ .为研究 HSS 对 EGF 受体介导下游信号传导的调节作用 , 本实验观察了 HSS 对人肝癌细胞系 BEL-7402 p21ras 表达的影响 , 以进一步探讨 HSS 作用的可能机制.
1、材料和方法
1.1 实验动物 [17]
    雄性初断乳 SD 大鼠 (60 ～ 90 g ), 节律光照饲养 1 周 (7∶00 ～ 19∶00 光照 , 19∶00 ～次日 7∶00 避光 ), 自由饮食.
1.2 HSS 的提取及部分纯化［ 18 ］
    将上述 SD 大鼠于第 8 日 7∶00 ～ 9∶00 之间断颈处死 , 剖腹摘取肝脏 , 制备 HSS .将 HSS 浓缩 (CT60, 丹麦 Heto 生产 ) 至 2 ml, 经 Sephadex-G75(Superfine, 瑞典 Pharmacia 公司 ) 层析 , 流动相为 DPBS(pH7.4), 洗脱速度为 35 ml/h .以分光光度计 (Lamda-Bio, 美国 PE 公司 ) 测定流分体积的吸光值 (OD280), 并以此为横坐标 , OD280 为纵坐标绘制蛋白的分离色谱图.


1.3 蛋白定量［ 19 ］
    蛋白定量采用 BCA 试剂盒 ( 美国 Sigma 公司 ) . BCA(bicinchoninic acid) 钠盐是一种稳定的水溶性复合物 , 可与 Cu+ 高度特异性结合 , 产生紫色复合物.该复合物在 562 nm 处有最大吸光值 , 并与蛋白浓度成正比.以 BSA 为标准品求得标准曲线 , 进而计算未知蛋白样品的浓度.
1.4 HSS 活性的体外测定
    实验采用 MTT 法［ 20 ］ 判定细胞增殖状况. HSS 粗提物经 Sephadex G-75 层析后 , 根据其 OD280 可绘成 3 个蛋白峰.选用人肝癌细胞株 BEL-7402, 以含 10% 胎牛血清 ( 美国 HyClone 公司 ) 的 DMEM( 美国 GIBCO/BRL 公司 ) 培养 , 按 5%26times;104/ml 细胞密度接种于 96 孔培养板 , 每孔含 5%26times;103 个细胞 , 于 37℃ 、 5% CO2 培养箱中培养.待细胞完全贴壁后 , 换用无血清培养基 DMEM( 内含 10 %26mu;g/ml 胰岛素 ) .取自上述蛋白流分体积中第 1 峰波谷至第 3 峰波谷 , 每隔 1 管取 50 　 %26mu;g 蛋白加入培养基 , 测定其促细胞增殖活性.另设对照 BEL-7402 细胞 , 加入等体积的培养基 , 但不含 HSS .孵育 24 h 后 , 每孔加入 20 %26mu;l MTT 溶液 (5 mg/ml, 北京华美生物工程公司 ), 继续孵育 4 h .之后 , 吸出孔内培养液 , 加入 150 %26mu;l DMSO, 以酶标仪 (Microplate Reader 550, 美国 Bio-Rad 公司 ) 测定各孔 490 nm 波长处的吸光值 , 以洗脱液流分体积为横坐标 , OD490 为纵坐标绘制 HSS 活性曲线.上述所有样品均以三孔重复测定.
1.5 HSS 分子量的鉴定［ 21 ］
    根据 1.4 结果 , 选取 HSS 活性洗脱部分 ( 相对于 220 ～ 230 ml 流分体积 ) 冷冻浓缩.分别取待测 HSS(100 %26mu;g) 和低分子量蛋白标准 ( 北京天象人生物工程公司 ) 进行 SDS-PAGE 和硝酸银染色.
1.6 细胞处理
    BEL-7402 细胞按 2%26times;105/ml 密度接种于 %26Phi;100 　 mm 的培养皿.细胞完全贴壁后 , 弃含血清培养基 , 以无 Ca2+ 、 Mg2+ DPBS 洗涤 3 次 , 换用无血清培养基 ( 内含胰岛素 10 %26mu;g/ml, 谷氨酰胺 2 mmol/L) 培养 24 h .设 4 个实验组 : (1) 对照组 , 不含 HSS 和 EGF; (2) HSS 组 , 加 HSS 50 %26mu;g/ml; (3) EGF 组 , 加 EGF 20 ng/ml (rhEGF, 美国 Promega 公司 ); (4) HSS+EGF 组 , 加 HSS 50 %26mu;g/ml 和 EGF 20 ng/ml .分别孵育 6 、 12 、 24 、 36 和 48 h 后收集细胞并裂解.以 Western blot 法测定 p21ras 的表达量.根据实验结果 , 选取 HSS 作用活性最强的时间点 , 加入不同浓度的 HSS(50 、 75 、 100 、 125 、 150 %26mu;g/ml) 观察其剂量 - 效应关系.
1.7 p21ras 蛋白表达的测定
    取 50%26mu;g 细胞蛋白和 5%26mu;g 预染 26.6 kD 蛋白标准品 ( 美国 Sigma 公司 ), 以 15% SDS-PAGE 分离 , 以半干转印仪 (Trans-blot SD, 美国 Bio-Rad 公司 ) 将胶中蛋白转至硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose membrane, NC, 美国 Bio-Rad 公司 ) .按照 Gallagher ［ 22 ］ 介绍的方法进行 Ras 蛋白杂交.简要为 : NC 膜于 4℃ 、 5% 脱脂奶粉 ( 安怡高钙脱脂奶粉 , 新西兰 )TBST 溶液中封闭过夜 ; 先后与抗 H-Ras 单克隆抗体 (1∶100, sc-35, 美国 Santa Cruz 公司 ) 及辣根过氧化物酶标记抗大鼠 IgG(1∶1?000, 美国 Santa Cruz 公司 ) 室温下孵育各 1h .之后 , 将膜充分漂洗 , 迅速加入发光试剂 ( 美国 Santa Cruz 公司 ) 进行发光自显影 ; 曝光于 X 光片上的自显影信号强度经密度扫描仪 (GS-700, 美国 Bio-Rad 公司 ) 扫描并经图像分析软件 (Molecular Analysist, 美国 Bio-Rad 公司 ) 处理 , 得出相应的光密度值.
2、结果
2.1 HSS 的部分纯化及活性测定
    超速离心所得 HSS 粗制品经 Sephadex-G75 部分纯化及其成分的活性检测之结果如图 1 .图 1 显示 , 层析图谱呈现出 3 个蛋白峰.以 MTT 法分析此 3 峰蛋白活性表明 , 仅第 3 峰起始处及上升支所对应的蛋白具有促肝癌细胞增殖活性 , 而其它流分体积中的蛋白无明显促细胞增殖作用.
2.2 HSS 分子量的测定
    选取上述最具 HSS 活性的洗脱蛋白 100 　 %26mu;g( 位于 fraction volume 220 ～ 230 ml 处 ), 进行 15% SDS-PAGE, 而后进行硝酸银染色.结果显示 , 部分纯化后的 HSS 主要由 3 条带组成 , 其分子量介于 14.4 ～ 20.1 kD( 图 2), 部分分离纯化所得 HSS 分子量大小与文献报道一致［ 18 ］ .


2.3 HSS 或 / 和 EGF 对 p21ras 蛋白表达的影响
    图 3 为 Western blot 杂交图 , 可见 , 随着 HSS 或 / 和 EGF 作用时间的延长 , 肝细胞 p21ras 表达逐渐增高. HSS 处理组的 p21ras 表达于 36 h 达到高峰 , 表达量增加 18.5%; 而 EGF 组于 24 h 达到高峰 , 表达量增加约 30.8%; HSS 和 EGF 联合应用组则增加到 54.5%, 提示 EGF 与 HSS 具有协同作用.根据 HSS 最佳作用点为 36 h, 本实验采用不同剂量的 HSS 处理细胞 36 h . Western blot 结果表明 , 随着 HSS 浓度的提高 , p21ras 表达也逐渐增大 , 呈现明显的剂量依赖效应.值得提及的是 , HSS 刺激 p21ras 表达也表现出饱和效应 , 即在 HSS 浓度升至 100 %26mu;g/ml 以后 , p21ras 表达不再改变 ( 见图 4) .这与我们前文报道的 HSS 上调 EGF 受体表达时观察到的 HSS 饱和浓度相似［ 16 ］ .
3、 讨论
    自 70 年代中期发现 HSS 以来 , 虽然受到一些学者的关注［ 5 ～ 10 ］ , 但至今有关 HSS 的作用机制尚不清楚.有学者认为 , 通过 Na+/H+ 交换 , HSS 可诱导 Na+ 的内流 , 进而形成 Ca2+ 的快速内流 , 刺激细胞 DNA 合成［ 22 ］ .本实验室新近报道 , HSS 刺激肝细胞增殖的可能机理是 : HSS 可诱导细胞 EGF 受体 (EGFR)mRNA 的表达 , 上调 EGFR 的数量 , 提高 EGFR 的亲和力和磷酸化程度 , 促进其内向化［ 15,16 ］ . EGFR 具有酪氨酸激酶活性 , 其活化后可诱导形成包括 Ras 在内的复杂的细胞信号传导通路 , 最终导致细胞增殖［ 24 ］ .
    p21ras 蛋白位于细胞膜内表面 , 本身具有 GTPase 活性 , 兼有效应分子和调节分子的共同特点 , 它可接受多种生长因子的作用而活化 , 调节如丝裂素活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 的活性 , 是信号传导通路中的关键一环［ 25 ］ . Gupta 等初步观察到 , HSS 能诱导 S 期进展基因 c-Ha-ras 、 H3 组蛋白和鸟氨酸脱羧酶基因的表达 , 以及 G0/G1 过渡基因 c-fos 、 c-jun 和 c-myc 的表达［ 26 ］ . EGFR 被 HSS 活化之后 , 其介导的细胞信号传递如何 , 尚不晓知.本实验结果显示 , HSS 可增强细胞内 p21ras 表达 , 并在一定范围内呈现剂量依赖性 , 且与 EGF 具有一定的协同效应.我们前文报道 HSS 具有上调 EGFR 活性之功能 , 结合本实验结果可推论 , HSS 促肝癌细胞生长系通过调节 EGFR 介导的信号传导通路所为. p21ras 可能参与 HSS 促肝细胞癌增殖的另一依据是 , 作为其下游分子 MAPK 蛋白的磷酸化水平在 HSS 的诱导下 , 亦见升高 ( 另文报道 ) .我们推测 , HSS 与肝细胞或肝癌细胞膜表面 EGFR 结合 , 促进 EGF 与受体的内向化 , 继而活化 EGFR, 后者则作用于膜内面 p21ras, 引发胞内信号传导的瀑布效应［ 27 ］ .
    目前我们已成功克隆到 HSS 基因 , 在此基础上 , 得到原核表达的 HSS 产物.还应指出的是 , 从本实验结果分析 , HSS 调节人肝癌细胞的增殖似通过 EGF 受体介导 , 因此 Michalopoulos ［ 3 ］ 将 HSS 归类为不完全性促肝细胞分裂原 (incomplete hepatocyte mitogen) .相信以 HSS 重组蛋白和制得的相应抗体进行示踪 , 将有助于深入了解 HSS 跨膜信号传导的分子生物学机制 , 揭示 HSS 作用之本质.
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    Corresponding author. Tel: 010-63291921; Fax: 010-63051130; E-mail: anwei@cpums.edu.cn
    戴杰（首都医科大学细胞生物学系 , 北京 100054 ）
    安威（首都医科大学细胞生物学系 , 北京 100054 ）
    高鼎成（首都医科大学细胞生物学系 , 北京 100054 ）
    陈莉（首都医科大学细胞生物学系 , 北京 100054 ）
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