实时定量PCR方法是近年发展起来的一种新的PCR定量技术,由于在PCR反应中引入了荧光探针,可以通过检测扩增过程中荧光信号的有无和强弱来判定目的基因的有无及表达量多少.分子信标（molecular beacon）探针就是其中一种荧光探针,它是在核酸杂交原理和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)现象的基础上开发出来的,可用于实时定量检测基因的表达水平［1,2］.
    Survivin是1997年［3］发现一种特殊结构和性质的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis,IAP）,它在终末分化的成人组织中很少表达,而在绝大多数肿瘤细胞中高表达［4～6］.本研究应用分子信标探针实时定量PCR技术检测了胃癌组织中Survivin 基因的mRNA表达情况,分析其与不同病理类型及临床资料之间的关系,探讨Survivin基因在胃癌的诊断、治疗和预后等方面的可行性.
1 材料与方法
1.1 标本收集 随机收集天津医科大学附属肿瘤医院胃肠肿瘤外科2001年11月～2003年11月手术切除的胃癌组织标本69组,每组包括肿瘤组织、癌旁组织、手术切端正常组织三份标本,离体后立即放入液氮中,后转入-80℃冰箱保存.男38例,女31例；年龄38～86岁,中位年龄56岁；按国际抗癌联盟（UICC）胃癌TNM分期：Ⅰ期3例,Ⅱ期23例,Ⅲ期29例,Ⅳ期14例；按组织学类型分类：低分化腺癌22例,乳头状腺癌2例,管状腺癌13例,黏液腺癌5例,黏液细胞癌10例,印戒细胞癌2例,混合性癌15例；按分化程度分组：乳头状腺癌和管状腺癌为分化较好组15例,其余为分化较差组54例；按生存期分组：24个月无转移复发为生存组,有转移复发或死亡为转移死亡组.经病理证实的胃良性标本47例,其中胃息肉1例,幽门口溃疡1例,胆汁反流胃炎1例,球部溃疡1例,豆疹样胃炎1例,慢性胃炎42例.
1.2 定量检测标准品制备——Survivin基因cDNA克隆 克隆方法如文献［7］所述,概括如下：取胎儿的脾脏提取总RNA,RT-PCR方法扩增出Survivin基因读码框部分cDNA,构建重组质粒.经序列分析证实克隆成功后,小量制备重组质粒,RNase A 消化RNA并纯化后,以260nm吸光度值计算含量,根据分子量计算拷贝数；倍比稀释后作为实时荧光定量检测的标准品.
1.3 引物和探针 根据GeneBank中Survivin mRNA序列,通过Oligo6.0分析软件设计引物和探针（上海生工合成标记）.上游：5’-CCT GGC AGC CCT TTC TCA-3’（75～92）,下游：5’-TCA GTG GGG CAG TGG ATG-3’ （178～195）,探针：5’-CCG CAT CTC TAC ATT CAA GAA CTG GCA TGC GG-3’ （106～125）,其中画线部分为分子信标探针中与靶序列无关的自身互补序列,斜体部分为Survivin基因探针的互补序列,检测片段大小121bp；探针的5’端标记荧光基团FAM,3’端标记淬灭基团DABCYL.
1.4 实时定量检测 20μl反应体系中加入10μl PCR SuperMix (Invitrogen公司产品),上、下游引物和分子信标探针各200nM,每管加入不同模板拷贝数的标准品或100 ng待测样本,补齐体积到20μl.反应条件为50℃温育2min,95℃预变性2min；95℃ 20s,60℃ 60s,40个循环.每个标准或样本重复2次.以每个标准拷贝数的对数为横坐标,以荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数（Ct值）为纵坐标,绘制标准曲线；并以精密度和回收率考证方法；根据被检测样品的Ct值,通过标准曲线计算出样本的模板拷贝数.
1.5 统计学方法 数据分析使用SPSS11.0软件包进行.Survivin mRNA的模板拷贝数以均值加减标准差（x±s）表示,模板拷贝数转换为对数进行统计分析,不同来源的组织样本间以及肿瘤组织中Survivin模板拷贝数与病理类型间的比较采用方差分析,与临床参数之间的比较采用独立样本t检验.
2 结果
2.1 标准品克隆 经过测序分析并与GeneBank比较,重组质粒的第385位发生碱基改变,由 A变为G,致密码子编码由赖氨酸变为谷氨酸.分子信标定量检测位置在1、2外显子的第75～195位之间,阳性克隆中碱基的改变并不影响作为定量检测标准品的使用.


2.2 实时定量检测 标准品检测范围103～1010个拷贝（见图1）,直线斜率a=-3.2253,截距b=46.2569,相关系数r=0.9954；批内变异为13.34%（n=20）,批间变异为28.16%(n=5),回收率为109.83%,实验中得到的最小检出量为42个拷贝数.
2.3 Survivin模板拷贝数与临床资料及病理类型之间的关系 本研究设定＞40个循环仍无荧光信号明显增加的样本,Survivin mRNA表达为阴性,数值以“0”计入统计资料.不同组织中Survivin mRNA模板拷贝数的结果见表1,肿瘤组织与其相应的癌旁组织比较差异无显著性（P=0.076）,与正常和良性组织比较差异有显著性（P=0.000）；癌旁与正常和良性组织比较差异有显著性（P＜0.05）；正常组织与良性组织比较差异无显著性（P=0.085）.肿瘤组织中Survivin mRNA模板拷贝数与临床资料之间的关系见表2,与病理类型之间的关系见表3,结果显示Survivin mRNA模板拷贝数与性别、年龄、TNM分期以及分化程度无关（P＞0.05）；与淋巴结转移、生存期和病理亚型有关（P＜0.05）.
    图1 标准品的实时荧光定量检测
    表1 实时定量检测不同组织中mRNA模板拷贝数
    表2 肿瘤组织mRNA模板拷贝数与临床资料的关系临床特征
    表3 肿瘤组织mRNA模板拷贝数与病理类型的关系病理类型
3 讨论
    分子信标探针是由Tyagi［8］首先建立起来的,它是一种具有“茎环”结构的发夹式探针,茎部分是与目的基因无关的互补序列,环部分是与目的基因互补的序列,探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团.无目的基因存在时,由于探针呈发夹结构,激发光作用时荧光基团吸收的能量通过荧光共振能量转移传递给与之接近的淬灭基团,以热的形式散失而不产生荧光；当有目的基因存在时,分子信标探针的“环”部分与目的基因互补结合,形成比发夹式探针更稳定的杂交二聚体,此时荧光基团和淬灭基团远离,在激发光作用下,荧光基团吸收的能量不能传递给淬灭基团,从而产生荧光.
　　影响分子信标探针构型稳定性的参数有茎环长度之比、茎的长度和GC含量等.首先,环的长度至少应是茎长的2倍以上,才可保证探针与目的基因杂交后,荧光基团与淬灭基团充分远离.其次,茎的长度应在6～12nt之间,序列中GC含量一般应在50%以上,方能有利于形成比较稳定的发夹结构.另外,定量检测扩增的片段大小一般应＜200bp,最好是在150bp以下,这样才可忽略扩增效率的差异.本研究所设计的探针茎长6bp,环长20bp,环长是茎长的三倍以上；茎中的GC含量达66.7%（4/6）；扩增片段的大小为121bp,完全满足作为荧光探针进行定量检测的需要.
　　Survivin是IAP家族的重要成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制蛋白,其抗凋亡作用远大于bcl-2家族,与肿瘤的发生发展关系密切.Survivin即可特异性地结合Caspase-3和Caspase-7而阻断刺激诱导的细胞凋亡过程,同时还可以通过与周期蛋白激酶CDK4结合释放p21-CDK4复合体上的p21,游离的p21再与Caspase-3结合,从而抑制Caspase-3的活性,阻止细胞凋亡［9］.因此引起了研究者的广泛注意.目前检测Survivin基因mRNA表达多采用定性或半定量RT-PCR方法［10,11］,得到的是模板经PCR扩增以后的结果,而非原始模板量；原位杂交的方法［12］ 所得到的结果是阳性率；即使采用实时定量的方法［13］,也是以管家基因作为参比进行相对定量.
　　本研究以Survivin基因重组质粒为标准品,测定了胃癌样本中Survivin基因mRNA绝对模板拷贝数,并分析了拷贝数与临床资料之间的关系.结果显示,Survivin基因模板拷贝数与有无淋巴结转移显著相关,与2年生存期显著相关,与病理类型显著相关.黏液腺癌组与乳头状/管状腺癌组、低分化腺癌组比较,黏液细胞/印戒细胞癌组与低分化腺癌组比较,混合性癌与低分化腺癌组比较,差异有显著性（P＜0.05）.由表3可知：分化较差组的黏液腺癌mRNA表达在几十个拷贝数,显著低于分化程度较好的乳头/状管状腺癌组,黏液细胞癌/印戒细胞癌组mRNA表达在几千个拷贝数,与乳头状/管状腺癌组比较虽无统计学差异（P=0.157）,但拷贝数两者相差几十倍,这可能与黏液细胞/印戒细胞癌组的变异较大有关.与乳头状/管状腺癌和低分化腺癌比较,胃黏液癌组织中Survivin基因mRNA表达较低,是否与它们之间发生发展的机制不同有关,有待于进一步研究.


　　不同临床分期比较,Survivin基因模板拷贝数无统计学差异,Ⅰ、Ⅱ期组平均值略高于Ⅲ、Ⅳ组.可能是因为Survivin基因的过表达在胃癌的发生、发展过程中是一个比较早期的事件,在初期即发生了重新表达；随着肿瘤的进展,Survivin基因表达增强,其自身存在的负性变异体Survivin-2B［14］以及其下游基因被激活,抑制Survivin基因的进一步表达.不同分化程度组间比较同样无统计学差异,由表2可知,分化程度较差组模板拷贝数低于分化程度较好组,如将分化程度较差组进一步分为黏液癌组和低分化腺癌组,三者之间比较差异有显著性（P=0.002）.
　　 总之,胃癌样本不同病理类型中Survivin基因mRNA表达的模板拷贝数存在差异,低分化腺癌最高,乳头状/管状腺癌次之,黏液癌较低；有淋巴结转移表达高于无淋巴结转移；2年转移死亡者表达高于未转移复发者,可成为评估胃癌的生物学行为及判断预后的指标.
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