目前认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质,与核外线粒体DNA的改变也有非常重要的关系［1-2］,国内外多项研究发现线粒体DNA的 D环区可能为线粒体DNA突变的热点所在,但不同的肿瘤,有关该区突变的频率报道存在明显差异［3-4］. 为了进一步研究大肠癌组织线粒体DNA的D环区是否存在共性的突变位点,并探讨这些共性的突变位点是否与大肠癌的发生机制有一定相关性,我们用银染 PCRSSCP技术结合测序的方法对40例大肠癌组织及对应的癌旁正常组织的线粒体DNA的D环区进行研究.

1 材料和方法
    1.1材料200310/200405,经南方医科大学南方医院手术切除证实为大肠癌患者的组织标本40(男22, 女18)例, 年龄32~75(平均53.6)岁, Dukes分期：B期6例,C期28例,D期6例. 线粒体DNA提取试剂盒购自杭州Vgene公司; 2×Pfu PCR MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒购自清华大学天为时代公司；银染PCRSSCP试剂购自广州威佳生物试剂公司.
    1.2方法按照线粒体DNA提取试剂盒上的步骤提取40例大肠癌及癌旁正常组织的线粒体DNA, 根据大肠癌线粒体DNA D环区的全长设计四对引物,分别为引物1: 5\'GATCACAGGTCTATCACCCTATTAAC3\', 引物2: 5\'GGTTTGGCAGAGATGTGTTTA3\'扩增355 bp的片段,引物3：5\'GCTTCTGGCCACAGCACTTA3\',引物4: 5\'GCCCGTCTAAACATTTTCAG3\',扩增313 bp的片段,引物5: 5\'CTTTCATGGGGAAGCAGATT3\',引物6: 5\'TGTTGGTATCCTAGTGGGTGA3\',扩增258 bp的片段,引物7：5\'CTATCACACATCAACTGCAACTC3\',引物8：5\'CATCGTGATGTCTTATTTAAGG3\',扩增 342 bp的片段,根据四对引物用PCR仪扩增线粒体DNA D环区的全长.
    成功扩增后取10 μL PCR产物,加入8 μL变性缓冲液(800 g/L去离子甲酰胺,20 mmol/L EDTA, 0.5 g/L溴酚蓝, 0.5 g/L二甲苯晴蓝)混匀, 96℃变性10 min,冰上骤冷,立即上样行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=291),0.5×TBE为电泳缓冲液,10 mA恒电流电泳5 h,直至溴酚蓝接近凝胶底部为止,取出凝胶,固定、银染、显色、摄片.
    将检测到突变的大肠癌的PCR片段纯化,经上海博亚生物技术有限公司进行测序后,将测序结果与基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的大肠癌线粒体DNA D环区的序列进行比对分析.

2 结果
    2.1线粒体DNA D环区扩增与电泳依据设计的四对引物成功扩增了大肠癌线粒体DNA D环区全长序列,其中引物3,4与引物7,8扩增的大肠癌线粒体DNA D环区序列如图1A,B所示.
    A：引物3,4扩增的mtDNA D环区PCR产物电泳图(312 bp); B：引物7,8扩增的mtDNA D环区PCR产物电泳图(342 bp).
    图1引物3,4与引物7,8扩增的mtDNA D环区电泳图(略)
    2.2银染SSCP检测将扩增的大肠癌和癌旁正常组织的线粒体DNA D环区的PCR产物行银染SSCP检测,结果发现7例大肠癌组织存在点突变,突变率为18%(7/40),突变位点分别存在于引物3,4和引物7,8扩增的mtDNA D环区的PCR片段中,其中在引物3,4扩增的PCR片段中检测到的2处点突变,如图2A,B所示.
    A：13N,13T,14N,14T,15N,15T,16N,16T 的SSCP结果提示13T发生点突变; 图B: 29N, 29T, 30N, 30T, 31N, 31T, 32N,32T的SSCP结果30T发生点突变.
    图2引物3,4扩增的PCR片段银染SSCP结果图(略)


    2.3线粒体DNA D环区的突变SSCP阳性的大肠癌组织的PCR扩增片段进行测序,结果发现498位C→T, 16298位C→T这两个突变位点在所有SSCP阳性的PCR扩增片段中均检测到,其他突变位点为无规律随机突变的位点.

3 讨论
　　线粒体DNA作为细胞核外的遗传物质与核基因一起制导呼吸链,其任何类型的突变都可能对细胞功能产生重要而深远的影响,目前国内外多项研究均已证实多种实体肿瘤中存在着线粒体DNA的突变,但这种突变与肿瘤发生发展的关系还不十分清楚.
    有关大肠癌组织线粒体DNA突变的研究国内尚未有人报道,国外虽有报道但意见不一,其中Habano等［5-6］在对45对结肠癌和正常组织的线粒体DNA的研究中,发现有7/45(16%)存在突变. Hibi等［7］检查了77例大肠癌患者大肠癌细胞及其相对应的血清中线粒体DNA的D环区改变,结果发现7例患者大肠癌细胞的线粒体DNA发生了突变,但突变发生的病理机制尚不清楚,本实验用银染PCRSSCP方法检测了40例大肠癌和癌旁正常组织线粒体DNA D环区点突变改变, 结果发现40例大肠癌组织中有7例检测到点突变, 突变率为18%(7/40), 与国外文献报道的大肠癌组织该区的突变频率基本类似,但本研究对检测到点突变的PCR片段进行测序分析时发现突变的大肠癌组织中均存在498位C→T, 16298位C→T这两个相同的突变位点, 与本课题组在4株大肠癌细胞株中检测到的共性突变位点相类似［8］,这些共性的突变位点在国外还未见有人报道过,考虑为一种特征性的改变,这种特征性的改变可能和大肠癌的易感性有关,结合所取大肠癌组织标本的Dukes分期发现,检测到的突变位点分别存在于Dukes C期和Dukes D期的大肠癌组织中, 而在 Dukes B期的大肠癌组织中未检测到,可见大肠癌组织线粒体DNA D环区的点突变改变可能也与大肠癌组织的恶性程度有一定的相关性,即恶性程度越高的大肠癌组织可能存在着较高程度的点突变.
　　线粒体DNA突变在肿瘤发生和发展中作用与机制的研究还刚刚起步,通过对大肠癌组织线粒体DNA D环区的研究,我们不难发现大肠癌组织中确实存在着一定程度的点突变改变,但这些改变是否是伴随着癌变发生而出现的特征性改变,是否与大肠癌发病机制相关以及能否为临床提供一种新型早期诊断大肠癌的肿瘤标志物,还须进行进一步研究.
　　【参考文献】
    ［1］ Allen M, Andreasson H. Mitochondrial Dloop and coding sequence analysis using pyrosequencing ［J］. Methods Mol Biol,2005,297:179-196.
　　［2］ Yoneyama H, Hara T, Kato Y, et al. Nucleotide sequence variation is frequent in the mitochondrial DNA displacement loop region of individual human tumor cells ［J］. Mol Cancer Res,2005,3(1):14-20.
　　［3］ Wheelhouse NM, Lai PB, Wigmore SJ, et al. Mitochondrial Dloop mutations and deletion profiles of cancerous and noncancerous liver tissue in hepatitis B virusinfected liver ［J］. Br J Cancer,2005, 92(7):1268-1272.
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　　［5］ Habano W, Sugai T, Yoshida T, et al. Mitochondrial gene mutation, but not largescale deletion, is a feature of colorectal carcinomas with mitochondrial microsatellite instability ［J］. Int J Cancer,1999, 83(5):625-629.
　　［6］ Habano W, Nakamura S, Sugai T. Microsatellite instability in the mitochondrial DNA of colorectal carcinomas: evidence for mismatch repair systems in mitochondrial genome ［J］. Oncogene,1998,17(15):1931-1937.
　　［7］ Hibi K, Nakayama H, Yamazaki T, et al. Detection of mitochondrial DNA alterations in primary tumors and corresponding serum of colorectal cancer patients ［J］. Int J Cancer, 2001,94(3):429-431.
　　［8］ 阎丽,肖冰,赖卓胜. 线粒体DNA变异在大肠癌发病中的作用与机制研究［J］. 中华消化杂志, 2005,25(6):376-377.

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