我们在近年的研究发现,将神经干细胞分别移植到切割穹窿海马伞侧海马和正常侧海马中,神经干细胞在切割侧海马中更易于存活、迁移和向神经元分化 [1,2].体外诱导分化发现,切割穹窿海马伞侧的海马提取液促进神经干细胞向神经元分化的作用也明显强于正常侧海马提取液[3].提示切割穹窿海马伞后,海马中某些诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的物质表达增强.新近我们还证实切割穹窿海马伞后也能促进切割侧海马中的自体神经干细胞向神经元分化. POU同源盒基因在中枢神经系统的发育过程中起重要作用,已证实其家族成员Brn-4作为重要的转录因子在胚胎纹状体神经干细胞向神经元分化过程中起调控作用[4].本文使用RT-PCR/Southern 杂交方法观察了切割穹窿海马伞后不同时间点大鼠海马Brn-4 mRNA表达量的变化,以期阐明Brn-4的表达变化与海马中植入的或自体的神经干细胞向神经元分化的相关性.
    1   材料和方法
    1.1   实验动物及分组   SD大鼠42只(南通大学实验动物中心提供),雌雄不拘,体重220〜250 g,随机分成7组,其中1组为正常对照组,其余6组分别为切割穹窿海马伞术后1、3、7、14、21和28 d组,每组6只.
    1.2   切割大鼠穹窿海马伞   上述各组大鼠,经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent(0.2 ml/100 g)麻醉后,固定于立体定位仪,暴露前囟,确定前囟坐标A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴),根据Paxinos图谱确定左右两侧穹窿海马伞的切割范围.先在颅骨上确定右侧两点即(1)A1=A-1.4、L1=L-4和(2)A2=A-1.4、L2=L-4；左侧两点即(3)A3=A-1.4、 L3=L+1和(4)A4=A-1.4、L4=L+4,每点各钻一小孔,用刀片将右侧(1)和(2)、左侧(3)和(4)点间颅骨划开一条骨缝,将针刀插入脑内至切割深度即V1－4=V+5.4,来回切割3次,退出针刀,待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝,缝合皮肤,肌注青霉素,动物按性别分笼饲养.
    1.3   RNA的提取   正常对照组及术后各组大鼠经上述方法麻醉后,断颈处死,无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜,再去除大脑皮质和胼胝体,证实两侧穹窿海马伞被切断后,取出两侧海马组织,置匀浆器中,加入1ml Trizol(BBI公司)充分匀浆,提取RNA.测OD260/280值,经甲醛变性电泳鉴定RNA质量,-70℃保存备用.
    1.4   RT-PCR   选用磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因为内参照.反应中所用Brn-4上游引物为：5′-GGGTGACCAGTCTTAGCGAC-3′,下游引物为：5′-GCGAGTACACATTGAGGGGT-3′,扩增产物为237 bp；GAPDH上游引物为：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物为：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3′,扩增产物为452 bp.（1）逆转录：使用逆转录试剂盒(BBI公司),以所提取的RNA为模板逆转录得到cDNA；（2）PCR反应：将目的基因与内参基因的引物置同一管内行PCR扩增,反应体系按试剂DNA聚合酶(MBI公司)说明书操作.预变性94℃,3 min,94℃,40 s、54℃,30 s、72℃,45 s,32个循环；最后延伸72℃,10 min；（3）琼脂糖凝胶电泳及半定量分析：取PCR扩增产物10 μl 和PCR Marker(TaKaRa公司DL2000)5 μl ,加样于1.5％ 琼脂糖凝胶加样孔内(含0.5 mg/L溴化乙啶),置0.5×TBE电泳缓冲液中,8 V/cm电压电泳30 min后观察结果.
    1.5   合成探针   参照GenBank设计分别与目的基因和内参基因杂交的DNA探针,委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成,探针序列如下.与目的基因杂交的探针序列为：5′-GGAGCAATCATCCATCACCGCTCGCCTCACGTAGC-3′,5′端为地高辛(DIG)标记；与内参基因杂交的探针序列为：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,5′端为地高辛(DIG)标记.
    1.6   Southern杂交鉴定[4~6]   RT-PCR产物用向下毛细血管法[7]转移至Hybond-N+尼龙膜(Amresco 公司)上,与用上述方法标记的目的基因和内参基因探针杂交,化学发光法观察结果.操作方法依照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ（Roche 公司）说明书进行.
    1.7   统计学分析   X胶片呈像后,用捷达图像分析系统对Brn-4 RT-PCR／Southern杂交条带和GAPDH RT-PCR/Southern杂交条带进行光密度扫描.以各组Brn-4与GAPDH RT-PCR/Southern杂交条带的光密度比值表示Brn-4 mRNA的相对表达量,建立相对表达量柱形图.数据输入STATA7．0统计软件,多个样本均数的比较用单因素方差分析,均数两两比较用q检验(SNK 法).    


     2   结      果
    2.1   目的基因探针敏感性检测   结果见图1,对其进行灰度扫描,并进行图像处理分析.已知标准探针浓度为1 ng/μl,根据各稀释度待测探针和标准探针的灰度比较,估测探针浓度约为300 pg/μl.
    2.2   内参基因探针敏感性检测   结果见图2,对其进行灰度扫描, 并进行图像处理分析.已知标准探针浓度为1 ng/μl,根据各稀释度待测探针和标准探针的灰度比较,估测探针浓度约为400 pg/μl.
    2.3   RT-PCR／Southern杂交检测结果   穹窿海马伞切割后不同时间点RT-PCR/Southern杂交检测Brn-4 mRNA含量如图3所示,Brn-4 mRNA相对表达量如图4所示,方差分析和均数两两比较表明,切割后l、28 d组与正常对照组相比,Brn-4 mRNA的相对表达量差异无x统计学意义（P>0.05）,3、7、14和21 d组与正常对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）；比较切割后不同时间组,除1 d组与28 d组间的差异无统计学意义外,其余各组间的表达差异均有统计学意义,说明Brn-4 mRNA表达量自切割后第3 d开始明显升高,14 d时达到最高水平,以后开始下降,于28 d左右恢复至正常水平.
    3   讨      论
    研究表明, 神经干细胞具有分裂、增殖特性和多分化潜能[8,9],这将使神经干细胞有可能成为治疗中枢神经系统损伤和神经系统退行性疾病的理想细胞材料.但影响神经干细胞分化为神经元的因素十分复杂,目前的研究发现大部分神经干细胞分化成了胶质细胞,仅少数分化为神经元[10],因此调控神经干细胞向神经元或特定表型神经元的定向分化研究具有重要的理论意义和应用价值.
    同源盒基因在中枢神经系统发育过程中扮演着重要角色[11],如POU家族、LIM家族等,它们的产物,作为转录因子参与体内一些与发育相关基因表达的调控[12].有研究观察到,脑源性神经营养因子在刺激胚胎纹状体神经干细胞向神经元的分化过程中,Brn-4表达显著上调；应用Brn-4的反义寡核苷酸则可明显阻断其向神经元分化[4].Le Moine等[13]发现,阻断来自黑质的多巴胺能神经纤维向纹状体的投射,可引起纹状体内Brn-4的表达上调.上述的研究均提示,Brn-4不但具有介导发育中的纹状体神经元分化的作用,而且与成年哺乳类动物去多巴胺能神经支配后纹状体内的神经再生和修复相关.
    本实验通过RT-PCR/Southern 杂交方法观察到切割穹窿海马伞后,海马组织内Brn-4 mRNA表达在第14 d明显上调,再一次验证了本课题组此前用RT-PCR方法做的结果.结合本课题组此前切割穹窿海马伞侧的海马微环境变化可以促进移植于其中的神经干细胞向神经元分化的研究[1~3],以及最近我们证实切割穹窿海马伞后也能促进切割侧海马中的自体神经干细胞向神经元分化等的研究,推测切割穹窿海马伞阻断了隔区胆碱能神经向海马的投射及损伤了穹窿海马伞中的海马传出纤维,海马中某些表达增强的物质可能通过诱导神经干细胞Brn-4表达上调,进而向神经元分化,这在某种程度上激活了机体内的再生机制,使机体具有自我修复的可能.Calza等[14]用192IgG-saporin特异性去除前脑的胆碱能神经元,然后在侧脑室中施加NGF,结果在海马中发现了再生的胆碱能神经元,就推测这些胆碱能神经元是由海马内自体神经干细胞增殖和分化而来.目前国内外对 Brn-4及其他POU家族转录因子的下游基因研究甚少,尤其对与神经干细胞分化相关的下游基因所知更少,所以在这方面还有待进一步研究.


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[3] 金国华,张新化,田美玲,等．穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用[J]．解剖学报,2004,40(2):141-145．
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