PCR产物克隆方法的新进展,随着PCR技术的发展和普及,克隆PCR产物已经广泛的应用于分子生物学的各个领域.通常PCR产物不具有粘端,只能进行平端连接的克隆,且由于taqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两条DNA链的3＇末端加上一个多余的碱基,致使平端连接的效率不高,克隆效率低.改进的方法一股是在PCR引物的5＇端加上限制性内切酶识别序列,或是改变引物中ｌ至数个核昔酸引入限制酶位点,然后用相应的酶处理PCR产物即可获得粘端,通过粘端的连接,可…平端连接
    通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低.因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条DNA链的3\'末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为3\'突出一个碱基的DNA分子.这种DNA分子的连接效率很低.在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率.对于较短PCR产物,用PUS19的HincⅡ位点进行克隆,以X－gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子.另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3\'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆PCR产物.引物决定PCR扩增产物的特异性与长度.因此,引物设计决定PCR反应的成败.
    PCR反应中有两种引物,即5\'端引物与3\'端引物.5\'端引物是指与模板5\'端序列相同的寡核苷酸,3\'端引物是指与模板3\'端序列互补的寡核苷酸.对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性,要求有16-30bp,因为4^16=4.29x10^9,已大于哺乳动物基因组3x10^9bp,保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度),亦会影响产物的特异性.②G+C的含量一般为40％-60％.③四种碱基应随机分布,不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在.尤其是引物3\'端,不应有连续3个G或c,否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补,而影响PCR的特异性.④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠,起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp.⑤两引物之间不应互补,尤其是它们的3\'端不应互补.一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性,以免产生引物二聚体.④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源,否则导致非特异性扩增.①引物3\'端是引发延伸的点.因此不应错配.由于ATCG引起错配有一定规律,以引物3\'端A影响最大,因此,尽量避免在引物3\'端第一位碱基是A.引物3\'端也不要是编码密码子的第三个碱基,以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性.⑧引物5\'端可以修饰,包括加酶切位点,用生物素、荧光物质、地高辛等标记,引入突变位点,引入启动子序列,引入蛋白质结合DNA序列等,引物的设计最好以电脑软件进行指导.
    反应体系中,引物浓度一般要求在O.1-0.5μmol之间.浓度太高,容易生成引物二聚体,或非特异性产物.
    引物Tm值与退火温度有关,计算公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T).引物Tm值最好在55-80℃范围,以接近72℃为最好.

相关阅读：
关于引物，Taq酶浓度单位的问题
影响限制性内切酶活性的因素
PCR产物量小或没有目的产物
减少PCR产物中引物二聚体的方法
大脑中有修剪神经元连接的细胞
siRNA表达载体
有可能用于基因疗法的“归巢核酸内切酶”