克隆实验的成功与否,除了与连接方式以及载体选择有关之外,载体的处理也是一个很重要环节.为了提高连接效率,处理载体时应注意以下几点：
(1)应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体,以保证载体被完全酶切；
(2)如用双酶切割载体,则必须电泳回收载体片段,除去双酶切所产生的小DNA片段；
(3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用
    碱性磷酸酶 (如牛小肠碱性磷酸酶,CIP)处理,防止载体自身环化.CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸.对于3末端突出的DNA(如PstI水解,需用10倍于5末端突出DNA(如EcoRI,HindⅢ)的CIP进行去磷酸化,以达到最少的载体自身环化.
去磷酸方法如下：
①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液,5端突出的DNA,每100pmol 5?磷酸基团加入1个单位的CIP,37℃反应30分钟.平末端或3端突出的 DNA,每2pmol 5 磷酸基团加1个单位CIP,37℃保温15分钟后,再加CIP,55℃反应45分钟(2μg 5kb的线性DNA约含14pmol左右的5磷酸基团)；
②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度05%、 5mmol/L和50μg/ml,混匀后56℃反应30分钟；或加EDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L,65℃保温1小时或75℃,10分钟灭活CIP;
③冷却至室温后,加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;10 mmol/L ZnCl210 mmol/L MgCl2100 mmol/L Tris・HCl,pH8.0.

相关阅读：
大脑中有修剪神经元连接的细胞
siRNA表达载体
有可能用于基因疗法的“归巢核酸内切酶”