摘　要　目的：在大肠杆菌表达人淋巴毒素 cDNA .方法：将本室克隆的人淋巴毒素cDNA亚克隆于原核表达载体pBV220,温控法诱导重组菌,SDS-PAGE和Western-blotting检测和鉴定结果,MTT比色法测定重组LT活性.结果：成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白；重组蛋白占细菌总蛋白的12%,并具有细胞毒活性,活性单位相当于2×105 U/L菌液.结论：为重组LT的大量生产、临床应用,为进一步研究人LT的生物学功能奠定了基础.
关键词：人淋巴毒素；表达；大肠杆菌.
    淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)又称肿瘤坏死因子β(TNF-β),它可在体内或体外特异地杀伤多种 肿瘤细胞,并具有抗病毒及免疫调节活性,因其细胞毒作用与TNF-α相似,而毒副作用大大低于TNF-α而倍受重视,是一种非常有前途的抗肿瘤和抗病毒生物制剂［1］.本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA［2］构建于原核表达载体,以期在大肠杆菌表达人淋巴毒素(rLT).

　　1　材料与方法
　　1.1　pBV-LT表达载体的构建　原核表达载体pBV220由中国预防医学科学院病毒所提供［3］,经内切酶SmaI切成双平端,同时将克隆于pUC18-LT中的去信号肽LTcDNA［2］经HindⅢ/Nco I双酶切,Klenow酶填平,载体与LTcDNA按常规方法连接并转化大肠杆菌DH5α,地高辛标记探针菌落原位杂交法初步筛选阳性重组子,可疑阳性重组子经酶切进一步鉴定并确定插入方向［4］,获得的正向阳性重组子命名为pBV-LT.
　　1.2　人LT cDNA在大肠杆菌的诱导表达　将含有pBV-LT的DH5α在30℃培养过夜,按1∶100稀释至LB培养液中,继续在30℃摇床培养至OD0.4～0.6,迅速转至42℃摇床诱生2～6 h,同时作未诱生菌和空载体对照［3］.
　　1.3　重组人LT的检测与鉴定　于诱生不同时相离心收集菌体,以1×SDS上样缓冲液溶解并煮沸后行SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色,脱色后观察结果,并在DU-600型紫外分光光度计上作薄层扫描分析,以计算阳性蛋白带的相对比例.Western-blotting按常规方法进行,以抗LT McAb(宝灵曼产品)与转移至NC膜上的重组LT蛋白带作免疫印迹反应［4］.
　　1.4　重组LT活性测定　按文献方法分离包涵体［4］.收集42℃诱导5 h的细菌100 ml,离心后每克湿菌加3 ml TE Buffer悬浮,超声粉碎、变性、复性后浓缩至1 ml,过滤除菌、备用.MTT比色法测定LT对培养的L929细胞的细胞毒活性［5］,以已知活性单位的rTNF-α(本校大坪医院产品,活性单位20 000 U/ml)为阳性对照.

　　2　结果
　　2.1　阳性重组子的筛选与鉴定　从108个pBV220/LT转化的菌落中经地高辛标记探针筛选出5个阳性菌落,质粒快速小量抽提后经RE酶切确认,这些阳性菌落均为带有插入片段的阳性重组子,其中1个为正向插入,4个为反向插入.
　　2.2　重组LT的表达与鉴定　pBV-LT经诱导后,在18～19 kD处出现一新的蛋白带,其表达高峰在诱导后4～6 h,包涵体样品在同样位置有一较浓的蛋白带,与文献报道的重组LT分子量大小一致［5］,薄层扫描分析表明,重组LT蛋白带占细菌总蛋白量的12%(图1A),Western-blotting显示,仅经诱导的pBV-LT在18～19 kD处有阳性反应,表明前述蛋白带确属人淋巴毒素蛋白(图1B).
　　2.3　重组蛋白的生物学活性　经MTT比色法测定,rLT与rTNF-α活性单位相当,均为20 000 U/ml,此1 ml rLT为100 ml菌液所得,因此相当于2×105 U/L菌液.
    Note:A.SDS-PAGE：Lanel,protein molecular weight markers,Lanes2 and3,pellet fraction of sonicated cells carrying the control plasmid(lane2) or pBV-LT(lane3).Lanes4,6,8 and Lanes5,7,9,total cell lysate of cells harboring pBV-LT grown at 30℃ or 42℃ for 2,4,6 h respectively.Lane10,total cell lysate of cells harboring pBV220 grown at 42℃ for 4 h.B.Western blotting.Lanes1,2,3 total cell lysate of cells harboring respectively pBV220(Lane 1,grown at 42℃ for 4 h)and pBV-LT(Lanes 2,3,grown at 42℃ for 4 and 6 h)

　　3　讨论
　　本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA构建于原核表达载体pBV220,筛选出的阳性重组子pBV-LT经温控诱导,成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白,该重组蛋白占细菌总蛋白的12%,并具有细胞毒活性,其活性单位相当于2×105 U/L菌液.本实验为rLT的大量生产和临床应用,以及进一步研究LT的功能奠定了基础.
　　本实验rLT表达量占细胞总蛋白量的12%,尚有进一步提高的必要,试用合适的高效表达载体,调整SD与ATG间的距离可能是有效的途径.另外,据文献报道,人LTcDNA具有多态性,即在其成熟肽第26位氨基酸有天冬酰胺(Asn,密码子AAC)和酪氨酸(Thr,密码子TAC)之分,而26位为Thr的cDNA,其蛋白表达量明显高于该氨基酸为Asn者［6］,本实验克隆的人LTcDNA正好是后一种形式.因此,通过定点突变将该编码基因由AAC改为TAC,有可能提高rLT的表达水平,而建立高效的rLT纯化方法也是获得高活性重组蛋白的重要条件,这些均是下一步将要开展的工作.

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