摘要: 
    1)离心沉淀cDNA 第一链,并重悬在50μl水中,加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／L Hepes,pH6.9,20m mol／L MgCl2,5 mmol／L DTT,0.14 mol／L KCl,1 m mol／L 4种Dntp),混合均匀....
    2)每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位,15℃反应20小时,此酶能识别cDNA 3’末端发卡环,并以其为引物,cDNA第一链为模板,开始第二链的合成. 
    3)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应.取样电泳,以提取第一链同样的方法分离沉淀dsDNA. 对于这样合成的dsDNA不是全长的DNA分子,所以,需要进一步用逆转录酶合成. 
    4)溶解上述dsDNA在20μl水中,再加入：1mol／L Tris.HCl pH8.3)5μl,1 mol／L KCl 7μl,250m mol／L MgCl2 2μl,20m mol／L 4种‘dNTP各2.5μl,700m mol／L β-MCE 2μl,加重煎水到48μl,加逆转录酶2μl (40单位)、42℃保温反应1小时. 
    5)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应,取样电泳,以同样方法抽提,分离沉淀dsDNA. 
    6)用两次合成的双链cDNA和单链cDNA在1.4％碱性琼脂糖凝胶上电泳,放射自显影后观察,如果dsDNA片段的长度是第一链cDNA的两倍,那么,合成便是成功的. 
    7)用核酸酶S1消化dsDNA,除去连接两条链的发卡环.

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