DNA甲基化与乳腺癌
    随着对肿瘤认识的深入,研究者发现乳腺癌的发生、发展过程中,除了致癌因素造成基因突变、缺失、扩增外,还存在 DNA 序列以外的调控机制的异常.如基因表型改变,包括 DNA 甲基化与组蛋白乙酰化异常等形式. DNA 甲基化是人类基因组发生的最为常见的一种表观遗传学事件,因而研究 DNA甲基化与肿瘤的关系成为当前分子生物学的热点之一.
1、DNA 甲基化
    DNA 甲基化是指在 DNA 甲基转移酶 (DNA methyltransferase, DNMT) 催化下,以 S- 腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到特定碱基上的过程. DNA 甲基化主要发生在 G/C 含量丰富的 CpG 二核苷酸位点 (CpG 岛 ) , CpG 岛对基因的表达起着调控作用,具有特殊的意义.
    在细胞遗传过程中,子代细胞拥有与亲代细胞相同的甲基化状态.如果这种模式在胎儿发育时期发生紊乱会增加儿童发生肿瘤的易感性,在人体衰老的过程中发生改变则会增加成人发生肿瘤的危险性.
2、乳腺癌基因与 DNA 甲基化异常
    肿瘤组织中的 DNA 甲基化异常可概括为肿瘤细胞中同时存在普遍性低甲基化 (hypomethylation) 及区域性高甲基化 (hypermethylation) 水平. Kobatake 等运用甲基化 - 特征性 PCR(MSP) 技术分析, p57KIP2 抑癌基因 (CDK 抑制物中 Cip/Kip 家族 ) 甲基化可使该基因低表达,这一特点对从分子水平阐明乳腺癌的发病机制发挥关键作用. Mirza 等认为抑癌基因 TMS1 (target of methylation-induced silencing-1 ,又称 ASC) 、 BRCA1 、 ERalpha 、 PRB 等在浸润性乳腺癌患者癌组织与外周血血清均存在甲基化异常现象.由于血清 DNA 中存在着较高频率的基因异常甲基化,并且与肿瘤组织的异常甲基化相关,可以通过检测血清 DNA 中相关基因的异常甲基化来协助乳腺癌的临床诊断.
    DNA 高甲基化,不仅可以直接或间接影响基因转录,也可导致 C-T 突变 ; 而低甲基化却可使原癌基因活化,形成突变热点,增加染色体的不稳定性,使转座子异常表达,两种改变均会引起基因表达异常,导致细胞恶变,最终形成肿瘤.
2.1 高甲基化异常
    目前已发现大量基因在乳腺癌中发生高甲基化. Dulaimi 等发现,存在一种或多种基因如 APC(adenomatous polyposis coli) 、 RASSF1A(ras association domain family 1a) 、 DAP-kinase (death-associated protein kinase) 等启动区高甲基化现象的乳腺癌血清或体液样本占总样本数的 94 ％. Jandrig 等研究发现 ST18( 乳腺癌抑癌基因 18 ,位于染色体 8q11 上,锌指蛋白 ) 在乳腺癌患者中高甲基化且失活. Lui 等报道,组织抑制剂 TIMP3 高甲基化与乳腺导管癌的高级别、淋巴结转移、 ER 和 PR 以及 c-erbB2 过表达有关.
    乳腺癌散发性病例的乳腺癌 BRCA1 基因中没有检测到体细胞突变这一点提示可能是甲基化导致该基因的失活.乳腺癌易感基因 BRCA1 等与 DNA 修复、凋亡、耐药、解毒、分化、代谢和血管生成相关的调控细胞基因有关 , 因此抑癌基因以及相关基因受高甲基化的不同影响而导致转录的活化或关闭,从而可引起细胞不受控制的增殖,导致组织发生恶变.
2.2  低甲基化异常
    在乳腺癌中可呈现广泛低甲基化,并且随着恶性程度的增加而渐进性增加. Gupta 等观察到 SNCG 基因 (syneclein γ,又称 BCSG1 ,该基因的表达与乳腺癌细胞的生长、浸润、转移、预后有关 ) 的低甲基化与乳腺癌中该基因的高水平表达密切相关.低甲基化可能通过活化原癌基因,或通过增强染色体的不稳定性而促进癌症发生. Tsuda 等应用免疫组化的方法对人乳腺癌细胞中 1 号与 16 号染色体的异染色质区域的组织学特性和染色体异常进行检测,发现 DNA 低甲基化,使乳腺癌组织具有更强的侵袭性.以往认为,在原发性乳腺癌患者中位于染色体 9p21 上的 INK4A( 编码 p16) 蛋白抑癌基因不发生点突变或缺失,而 Bisogna 等研究表明在原发性或转移性乳腺癌细胞中 p16(INK4A) 普遍性低甲基化现象明显.
    目前,在乳腺癌患者肿瘤细胞中分离出的如 APC 、 RASSF1A 、 BRCA1 、类固醇受体基因等的高甲基化与肿瘤细胞基因的普遍性低甲基化,两者在肿瘤的发生发展中哪一个发挥更重要的作用尚不清楚.


2.3 甲基化与肿瘤基因突变及染色体结构改变的关系
    除了高或低甲基化引起基因异常外, DNA 甲基化的异常易受外源致癌物的影响而发生突变,导致细胞的癌变.异常 CDH1 基因 (cadherin 1 ,位于染色体 16q22.1 ,编码细胞表面黏附蛋白 )CpG 岛甲基化是乳腺癌发生、发展及预后的重要因素之一. Caldeira 等 [14] 认为,乳腺癌患者异常 CDH1 基因发生较高频率的甲基化现象,致使抑癌基因失活且与存活率下降、不良预后和转移有关.此外,基质镜质体 (DSC3) 基因沉寂在乳腺癌中与异常胞嘧啶甲基化和染色质结构改变有关. Zhang 等研究,人乳腺癌细胞中 ER alpha 沉寂的关键因素之一是 DNA 甲基化使染色质钝化.
    因此, DNA 甲基化与染色体结构改变的关系,间接通过和甲基化结合蛋白相连,恢复组蛋白的去乙酰化和使 DNA 甲基转移酶的失活改变染色质结构,抑制基因表达,进而促成了乳腺癌的发生与发展.
3、DNA 甲基化与乳腺癌的诊治
3.1  DNA 甲基化与乳腺癌的早期诊断
    DNA 甲基化常发生在肿瘤发生的早期且不同肿瘤有其特异的基因甲基化,针对某个或某些基因甲基化检测为肿瘤的早期诊断提供了一个新依据.
    Lo 等研究表明,在乳腺癌患者组织中存在 SFRP1( 编码 secreted frizzled-related protein) 异常的高甲基化且频繁表达,因此可将 SFRP1 作为诊断乳腺癌的有价值标记. Yeo 等 [18] 报道, RASSF1A 高甲基化以及高频率出现于乳腺癌患者的肿块以及非肿块组织中,同时肿块组织的甲基化水平要远远高于非肿块组织.因此 RASSF1A 也可用来早期诊断乳腺癌.
    现已经发现和证实了乳腺癌中特有的一些基因的甲基化改变.但甲基化作为肿瘤早期诊断的指标也存在很大局限性,需要依赖许多条件,单一的某段 DNA 序列的甲基化模式的改变不能作为肿瘤早期的诊断指标.
3.2 DNA 甲基化与乳腺癌的治疗
    DNA 甲基化需要 DNMT 的催化, DNMT 的抑制因子可通过使抑癌基因去甲基化恢复其活性达到肿瘤治疗的目的.现已知的 DNMT 的抑制因子主要指胞嘧啶的类似物 5- 氮 -2- 脱氧胞苷 (5-AZA-CdR) 和 5- 氮 - 胞苷 (5-AZA-CR) 等,而以前者应用较为广泛,其在 DNA 复制时竞争性地与 DNMT 结合,导致 DNA 合成时缺乏 DNMT ,使基因序列去甲基化,已证实 5-AZA-CdR 在体内、外均可以使大多数高甲基化的肿瘤相关基因去甲基化恢复其表达而抑制肿瘤. Hurtubise 等实验证明, 5-AZA-CdR( 有效的脱甲基因子,使被异常甲基化的抑癌基因重新恢复活性 ) 和 LAQ( 新型的组蛋白乙酰基转移酶抑制剂 ) 有希望被应用于临床治疗乳腺癌中. Shao 等也证实,在乳腺癌等恶性肿瘤的基因高敏感区存在 CpG 岛甲基化使基因沉寂,并发现 Betaig-h3( 编码转化生长因子 TGFB1 基因 )CpG 岛高甲基化和 Betaig-h3 基因表达缺失,但在使用 5-AZA-CdR 后 Betaig-h3 基因复活和重新表达,这为治疗乳腺癌提供了依据.
    化学药物疗法是目前常用的治疗乳腺癌的方法之一,耐药性问题已成为治疗中的一大瓶颈. Chekhun 等研究阿霉素对 MCF-7 乳腺癌耐药与多重耐药基因 (multi-drug resistance1 , MDR1) 、谷胱甘肽转移酶同工酶 (glutathione S-transferase pi,GSTpi) 、 6- 氧 - 甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶 (O6-methylgua-nine DNA methyltransferase , MGMT) 和尿激酶型血纤溶酶原激活剂 (urokinase-typeplasmingen activator,Upa) 基因的低甲基化有关. Chang 等对枸橼酸它莫西芬耐药的乳腺癌的研究表明, ER beta 基因甲基化明显,而且甲基化程度越高耐药性就越强.对异常甲基化的研究有利于进一步提高药物的疗效,减少耐药性和毒副反应事件的发生,进而为拟订乳腺癌的综合治疗提供依据.
3.3 DNA 甲基化与乳腺癌的预后
    Shinozaki 等认为, CDH1 是最易甲基化的基因而且对乳腺癌的转移有重要影响,高甲基化在癌症早期是极为关键的病理预后因素之一. Silva 等在病理诊断为乳腺癌患者的肿块组织、正常组织以及细胞中提取 DNA 进行分析发现 p53 基因突变和 p16(INK4a) 异常甲基化,若在细胞浆中同时出现则提示预后不良.目前在对乳腺癌的研究领域中,对 p16(INK4a) 已有了很大的认识,但对 p14ARF( 位于染色体 9p2 的 CDKN2A 基因位点 ) 的分析却进行的很少. Silva 等试验分析 p14ARF 突变、促高甲基化等发现, p14ARF 表达降低与预后不良有关.可见,乳腺癌患者体内细胞中 DNA 异常甲基化可用于判断患者的临床预后.
4、结语
    人类表观基因组计划已于 2003 年正式启动, DNA 甲基化作为主要研究内容日益受到人们的关注.由于 DNA 的甲基化状态可被逆转,可恢复细胞正常生长调控功能,使针对肿瘤的去甲基化治疗成为可能.今后针对 DNA 去甲基化治疗将成为肿瘤基因治疗的新热点,并将更好地应用于乳腺癌临床的诊治和预后判断.