质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体,它在基因操作中具有重要作用.质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术.
      质粒的提取方法很多,大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化.本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程.
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用.
实验材料：含有质粒 pUC18 载体的大肠杆菌菌液,克隆有水稻外源片段的 BAC 的大肠杆菌菌液.
实验原理：在 pH 12.0 ~ 12.6 碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开,而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态.将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀,而质粒 DNA 仍然为可溶状态.通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质,质粒 DNA 尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA .
实验步骤：
1、取含有 pUC18 质粒的大肠杆菌菌液于 LA 培养基上 37 ℃ 过夜培养；
2、用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中, 37 ℃ 摇床 ~250 r/min 过夜培养；
3、吸取 1.5 ml 菌液, 12000 g 离心 2 分钟,收集菌体,倒掉菌液；吸取 1.5 ml 菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净；
4、加入 300 ml 溶液 I 振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；
5、加入 300 ml 溶液 II ,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过 5 分钟；
6、加入 300 ml 溶液 III 颠倒混匀,放置于冰上 10 分钟,使杂质充分沉淀；
7、12000 g 离心 10 分钟；
8、吸取 800 ml 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一 Eppendorf 管中,加入 2/3 体积的异丙醇,室温下放置 5 分钟；
9、12000 g 常温离心 15 分钟；
10、倒尽上清,加 75 ％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心 3 分钟后倒去上清）；
11、室温放置或超净台上风干 DNA ；
12、加 40 ml 灭菌超纯水或 TE 溶解；
13、质粒、 BAC 的质量检测,于 -20 ℃ 保存.
附注：质粒检测
    电泳检测：质粒电泳一般有三条带,分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型
    吸光值检测：采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值,若吸光值 260nm/280nm 的比值介于 1.7 － 1.9 之间,说明质粒质量较好, 1.8 为最佳,低于 1.8 说明有蛋白质污染,大于 1.8 说明有 RNA 污染.

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