一、目的与原理
    DNA 酶切片段的联接是两 DNA 片段相邻的 5‘ 磷酸和 3’ 羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键,这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4DNA 连接酶催化,但是分子生物学试验中主要采用 T4DNA 连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应.本实验拟通过 T4DNA 连接酶对酶切片断的连接操作,掌握这一 DNA 片段的连接技术.
二、材料和方法
1 、仪器
    离心机,恒温设备,真空干燥机,取液器
2 、试剂
    T4DNA 连接酶, 10×T4DNA 连接酶缓冲液、 200mM Tris-HCl(pH7.6) 、 50mM MgCl2 、 50mM DTT 、 500μg/ml 牛血清白蛋白、 5mM ATP 、 λDNA 、酚, TE 缓冲液,电泳缓冲液、 3M NaAc
三、操作步骤
    取干净、灭菌新 Eppendorf 管,按下表加入各试液
    试液 体积（ μl ）
    T4DNA 连接酶缓冲液 1.5
    λDNA 10
    ATP 1
    无菌水 1.5
    连接酶 1
    总体积 15
    19--20 ℃ 保温 2 小时,提取已连接好的 DNA 片段.电泳分析.
四、结果 （略）
五、注意事项
1 、 该实验用的 T4DNA 连接酶最适反应是 37 ℃ ,但该温度下 DNA 退火效率低,连接效率还不如 22 ℃ 高.
2 、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的 λDNA .若连接成功,则说明有效.

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