【摘要】    目的 基因沉默人膀胱移行细胞癌细胞T24的STAT3基因,并探讨其对T24细胞生长抑制及诱导凋亡的作用机制.方法 利用含有STAT3 mRNA的siRNA 的pSilencer 3.1-siRNA-STAT3重组质粒转染T24细胞；采用Western 印迹、RT-PCR等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响；用MTT法观察重组质粒对T24细胞的体外生长抑制作用；用流式细胞术（FCM）及吖啶橙染色检测重组质粒的诱导凋亡作用.结果 重组质粒成功转染T24细胞；Western blot、RT-PCR证实重组质粒在蛋白及mRNA水平都显著抑制STAT3基因的表达水平,抑制率为59%～72%；MTT及FCM证实重组质粒可显著抑制T24细胞的体外生长并诱导细胞凋亡,抑制率及凋亡率分别为53%和17.3%.结论 pSilencer 3.1-siRNA-STAT3重组质粒可抑制STAT3在人膀胱肿瘤细胞的表达,抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡.
【关键词】  膀胱肿瘤；小干扰RNA；STAT3；凋亡

     文献报道信号传导与转录激活因子（STAT）3的过度激活及表达可导致细胞的异常生长及凋亡抑制,进而引起癌变〔1〕.STAT3作为肿瘤研究及治疗新的靶点越来越受到重视.小干扰RNA（siRNA）或称RNA干扰（RNAi）技术就是利用长度为21个碱基的小的双链RNA降解同源mRNA以引起特定mRNA的沉默,从而使其失去作用〔2〕.本实验拟利用含有针对STAT3 mRNA siRNA的重组质粒转染人膀胱移行细胞癌细胞T24,在体内通过生成带有发夹结构的双链RNA来抑制STAT3基因的过度表达进而抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡.本文首次报道了应用RNAi技术沉默 STAT3基因可诱导人膀胱肿瘤细胞生长抑制并诱导细胞凋亡.

    1  材料与方法
    1.1  材料  带有H1启动子的质粒载体（pSilencer3.1-H1）为美国ambion公司产品；人膀胱移行细胞癌细胞T24购自美国ATCC司；IMDM培养基、胎牛血清、胶回收试剂盒、RT-PCR试剂盒、TRIZOL试剂盒购自北京鼎国生物技术公司；质粒提取试剂盒、转染试剂购自大连宝生物公司；兔抗人STAT3多克隆抗体、碱性磷酸酶（ALP）标记羊抗兔IgG多克隆抗体及兔抗鼠IgG多克隆抗体为Santa Cruz产品.
    1.2  重组质粒pSilencer 3.1- siRNA-STAT3的构建  在STAT3mRNA（Genebank ：NM003150）上寻找符合特征的靶序列,合成针对其编码区2 143～2 162位碱基序列的两条DNA寡核苷酸链,每条正义链包括5＇末端BamH酶切位点和反向一致的两个靶序列（19 bp）,由9个非同源序列（TTCAAGAGA）所间隔.3＇末端加有TTTTTT以及Hind 酶切位点.合成的两条互补寡核苷酸链在退火缓冲液（100 mmol/L醋酸钾,pH7.4 30 mmol/L HEPES-KOH,2 mmol/L醋酸镁）作用下退火（90℃ 1 min,37℃ 18 h）,形成双链结构；将pSilencer3.1-H1（ambion,USA）分别用BamH 和Hind限制性内切酶进行消化,在T4 DNA连接酶的作用下,上述两者于16℃连接反应过夜,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,铺琼脂糖培养板,挑取阳性克隆,扩增,提取质粒测序鉴定.将与人的任何基因序列均无同源关系的DNA序列按上述方法构建重组质粒作为阴性对照〔3〕.
    1.3  细胞培养及转染  取对数生长期T24细胞,以1×106 ml-1的密度接种于100 ml培养瓶中,用含10%胎牛血清的IMDI培养液培养,5%CO2条件下,培养至80%～90%细胞融合.用无血清培养液洗3遍,将重组质粒（pSilencer3.1-siRNA-STAT3）及空质粒和脂质体用无血清培养液按1:20混合后,于室温放置20 min后缓慢滴入培养瓶中,在含10%胎牛血清的培养液中培养72 h,收获细胞以备进一步实验.
    1.4  细胞生长抑制实验及细胞凋亡检测  取对数生长期T24细胞,以2×104 ml-1细胞密度接种于96孔培养板,每孔用100 μl无血清培养液培养.分为空白对照组、转染空质粒及重组质粒实验组.剂量为质粒6 μg、脂质体5 μl,转染后培养48 h,在相差显微镜下观察形态变化.MTT检测：每孔加20 μl MTT（5 g/L）,温箱孵育4 h,弃去上清,再加入150 μl的二甲基亚砜（DMSO）,振荡器上振荡10 min,在酶联检测仪上测波长570 nm光的吸光度（A）值.按公式抑制率（%）=（对照组A均值-实验组A均值）/对照组A均值×100%计算各组抑制率,抑制率＞30%即细胞对重组质粒的抑制作用敏感.细胞存活率%=实验组A均值/对照组A均值×100%.重复本实验2次.流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡峰.用pSilencer 3.1-siRNA-STAT3重组质粒转染T24细胞72 h后收集1×106个细胞,离心、用PBS清洗细胞3遍后,将细胞用1 ml注射器快速注入70%冷乙醇中,4℃固定24 h.PBS清洗2遍后,调整细胞浓度为1×105个细胞,用RNase消化后碘化丙啶（PI）染色,混匀后流式细胞仪进行单参数分析,用累计曲线分割法计算各期细胞所占比例.G1峰前面出现的亚2倍体峰即为凋亡峰.用吖啶橙染色凋亡细胞.
    1.5  RT-PCR  以RT-PCR 法检测在siRNA 干预下T24细胞STAT3 mRNA 的表达改变.实验分正常T24细胞、转染空质粒的T24细胞和转染重组质粒的T24细胞,每组细胞均设3 个复瓶.分别收集转染48 h后各组T24 细胞,然后使用TRizol提取总RNA 逆转录成cDNA,最后进行PCR 反应.引物序列为:上游引物:5′TTGCCAGTTGTGGTGATC3′,下游引物 5′AGACCCAGAAGGAGCCGC3′.结果以其和内参照β-actin 吸光光度值的比值来反映其相对含量. PCR 反应条件为94℃预变性5 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃40 s,30 个循环,最后72 ℃延伸 10 min.2 %琼脂糖凝胶电泳分析.
    1.6  Western 印迹  用细胞裂解液提取细胞总蛋白,用Biofrad法定量后,进行Western 印迹分析：取50 μg上样,10%SDS-PAGE胶垂直电泳,电流20 mA,60 min.电泳结束后,按5.5 mA/cm2电转移50 min到PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭过夜,室温1 h,加入1∶500稀释的兔抗人STAT3一抗,室温3 h,TBST洗膜3×10 min,加入1∶2 000稀释的ALP标记羊抗兔STAT3二抗,室温1 h,TBST洗膜3×10 min,用ALP显色液显色,终止液终止.
    1.7  统计学分析  所有数据均以x±s表示,采用t检验和方差分析.

    2  结果
    2.1  pSilencer 3.0-siRNA-STAT3重组质粒可明显抑制T24细胞生长  用MTT法检测转染重组质粒的T24细胞的生长抑制情况,发现重组质粒能显著抑制T24细胞的生长,并呈时间依赖性,抑制率可达到53%.相差显微镜下,对照组细胞贴壁生长、状态良好,多为梭形、核仁清晰、可见核分裂相；转染重组质粒的细胞贴壁不好,形态不规则、数量明显减少、细胞皱缩、颗粒增多、可见细胞碎片.图1可见,pSilencer 3.1-siRNA-STAT3能抑制人膀胱肿瘤T24细胞的增殖,空白对照组及转染空质粒组细胞的增殖不受抑制且两者无明显差异（P＞0.05）,而与对照组相比,转染重组质粒的细胞呈现出明显的生长抑制,差异显著（P＜0.01）.
    三组T24细胞的72 h STAT3表达的MTT结果（略）
    2.2  RT-PCR结果  STAT3基因PCR扩增片段长度为125 bp,β-actin基因PCR扩增片段长583 bp,PCR产物电泳条带位置与大小相符,如图2.与对照组相比转染siRNA-STAT3重组质粒的T24细胞STAT3的mRNA 表达水平明显下调,抑制率为63%,与细胞生长抑制实验结果相符.
    三组T24细胞的STAT3表达的PCR结果（略）
    2.3  Western 印迹结果  转染重组质粒72 h后Western印迹结果见图3.图4可见siRNA-STAT3在蛋白水平对STAT3的表达的抑制作用最为明显,达58%.
    Western印迹分析转染pSilencer 3.1-siRNA-STAT3的T24细胞24、48、72 h 后STAT3-3蛋白表达（略）
    转染72 h各组T24细胞STAT3-3蛋白表达（略）


    2.4  FCM检测细胞凋亡峰  FCM检测结果显示,转染siRNA-STAT3重组质粒的细胞出现较明显的凋亡峰,对照组细胞未见凋亡及细胞周期的改变.Si-STAT3 转染组72 h后T24细胞凋亡百分比（17.3±3.78）明显高于空白组（0.00±0.00）、空质粒组（3.20±1.74）（P＜0.01）.
    2.5  吖啶橙染色结果  荧光显微镜观察:细胞未发生凋亡时,细胞核为均匀绿色荧光,核内RNA 为红色;当发生凋亡时,细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色,甚至可见黄绿色碎片.细胞坏死时,细胞质内绿色或橘黄色荧光均可减弱或消失.转染siRNA-STAT3重组质粒的T24细胞出现凋亡,而对照组未见凋亡（如图5）.
    转染pSilencer 3.1-siRNA-STAT3的结果（略）

    3  讨论
    STAT3是STAT蛋白家族一员.许多研究表明〔2～4〕,STAT3激活是多种原癌基因诱导细胞癌变所必需,即STAT3通过持续酪氨酸磷酸化（持续性活化）及过度表达来对抗细胞的正常凋亡机制,使细胞过度生长及凋亡障碍,进而癌变；同时更多证据表明拮抗STAT3的这一作用能够对肿瘤的分化和进展起明显抑制作用.STAT3正在成为人们研究治疗肿瘤的新靶点,已有学者将STAT3定义为癌基因〔5〕,而目前主要研究都集中在针对STAT3靶基因的反义技术及显性负性蛋白表达上,这已在骨髓瘤〔6〕、黑色素瘤〔7〕、鼻咽癌〔8〕及乳腺癌〔9〕、前列腺癌〔10〕等多种肿瘤的研究中得到确认.而在本试验之前的准备实验中同样发现膀胱肿瘤中存在着STAT3基因的过度表达.
    目前,拮抗STAT3基因表达的方法主要集中在反义核酸技术、构建STATs的显性突变体及构建受体胞浆区的点突变体上,还有应用与STAT3竞争DNA结合位点的诱饵寡核苷酸技术.针对STAT3靶基因的反义技术现在主要是利用反义核酸技术来拮抗STAT3的表达,主要有STAT3分子的反义核苷酸、反义RNA及核酶.应用上述技术使STAT3的表达减少,也就是使能够酪氨酸磷酸化、形成二聚体进入细胞核内调节靶基因表达的活化STAT3数量减少,通过这样一种方式来达到从STAT3入手在基因层面治疗肿瘤的作用.但是,上述方法却存在着针对性及特异性不强及抑制效率低下等问题,在RNAi技术问世之前被广泛应用,而RNAi技术的特点之一就是抑制效率高,微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量明显下降,达到剔除的效果;同时,RNAi的抑制作用具有严格的序列特异性,治疗的针对性强,副作用小.特异性:siRNA与靶mRNA即使只有一个碱基错配也不能产生基因封闭作用,所以siRNA只抑制靶序列而不会影响其他基因表达.作用强大:能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下,使目标基因表达降低(knock down)甚至完全“敲除”(knock  out).为此,我们应用RNAi技术构建了针对膀胱肿瘤STAT3 mRNA的siRNA重组质粒pSilencer 3.1 -siRNA-STAT3,应用真核细胞转染技术将其导入人膀胱细胞癌细胞T24,观察重组质粒对STAT3表达的影响,进而观察STAT3在膀胱肿瘤发生发展中的作用.显微镜下转染siRNA-STAT3的T24细胞和转染空质粒的细胞及对照组细胞相比出现明显的形态学上凋亡的改变.MTT,FCM结果表明重组质粒可显著抑制T24细胞的体外生长并诱导细胞凋亡；RT-PCR、Western印迹分别从mRNA及蛋白质水平证实重组质粒明显抑制STAT3的表达,并发现伴随着STAT3表达的降低出现肿瘤细胞生长的抑制、肿瘤细胞的凋亡.
    以上结果提示STAT3基因的过度表达与膀胱肿瘤的发生发展关系密切,且能够通过阻断其表达达到治疗肿瘤的目的,为膀胱肿瘤的基因治疗提供了借鉴.

相关阅读：
癌基因沉默的新途径
基因沉默临床研究获成功
用RNaseIII制备siRNA库来诱发RNA
哈医大新文章：揭示miRNA调控机制