1 ）取 10ul 待测 DNA ,于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳. (20mL,1.0% 凝胶 ,)
2) 凝胶用溴化乙锭染色,切掉凝胶四周多余部分,并在凝胶的一角作一记号 , 拍照
    记录电泳结果 ( 拍照时 , 凝胶旁放一尺子 ) .
3) 杂交用胶的制备 ( 做以下步骤两组合一 )
    A ．将凝胶浸没入 30mL 0.25mol/L HCl 溶液中 15min ,使 DNA  脱嘌呤.
    B ．用蒸馏水短暂洗凝胶 2 次.
    C ．将凝胶浸没入 30mL 变性液中 30min, 使凝胶变性.
    D ．将凝胶浸没入 30mL 中和液中 15min 使它被中和.
    重复 D 一次.在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等 (4 、 5) .
4) 准备 DNA 从凝胶向膜转移的平台
5) 将 1 张待用尼龙膜和 3 张厚滤纸切成与待转移胶相同大小,并在尼龙膜一角做一标记.
    另 1 张厚滤纸切成与凝胶相同宽度,长度 ( 约 18cm) 足以达到转移液盒子的底部.
    准备 10 X SSC 转移液.
    将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后,再浸入 10 X SSC 转移液中.
6 ）安装毛细管转移装置
    A ．将长的滤纸放在转移平台的顶部,滤纸两端达到转移盒的底部,做成虹吸桥.
    B ．将 8 0mL 转移液倒入转移盒内,并湿润滤纸.
    C ．将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上,凝胶与滤纸间避免有气泡.
    D ．用保鲜纸封住凝胶四边.
    E ．将浸湿的转移膜置于凝胶的上部,凝胶与膜间避免有气泡.
    F ．将剩下的 3 张滤纸小心的放在转移膜的上面,并放一叠吸水纸搭在滤纸上,再放一玻璃板,其上压一重物.
    G ．转移几小时或过夜 ( 至少 4 小时 )
    注意：勿使转移液干枯.
7) 已转移的 DNA 与膜交联
    A ．将膜放在浸有 10 X SSC 的厚滤纸上,有 DNA 的一面朝上.
    B ．将膜置于 UV crosslinker 中,在紫外光下自动交联.
    C ．用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜,空气中干燥.
    此膜可在 4oC 长期保存.
8)DNA 探针的制备 ( 略过 )
    参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针.
9 ）印迹的预杂交
    将适量的预杂交液 DIG Easy Hyb 在 42 oC 预热.
    放入印迹膜 , 在 42 oC 预杂交 30min .
10) 准备探针
    水煮地高辛标记的探针 5min 使变性 , 并立即放在冰上 2min.
11) 加适量的探针到已预热的杂交液中 , 混合均匀 ( 避免形成泡沫 , 影响杂交效果 ) .
    42 oC 杂交至少 4 小时或过夜.
    注意 : 不要将探针直接加在印迹膜上,而应加在容器一角的预杂交液中
12 ）印迹膜的冲洗：
    A ．将杂交液倒出,储存起来可再次使用.
    B ．用 25mL 的 2 X SSC,0.1% SDS 在室温摇动洗膜 2 次 , 每次 5min .
    C ．用已预热的 30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在 65 oC 摇动洗膜 2 次 , 每次 15min ( 用杂交炉 ).
13) 免疫检测 :
    A. 用 10mL 冲洗液洗膜 1-5min.
    B. 膜在 15mL 阻断液中孵育 30min
    C. 膜和 8mL 抗体孵育 30min
    D. 在 15mL 冲洗液中洗膜 2 次 , 每次 15min.
    E. 在 15mL 检测液中平衡 2-5min.
14) 将膜的有 DNA 的面朝上 , 放在保鲜纸上 , 滴数滴 CSPD ready-to-use 覆盖膜 ; 然后 , 立即用保鲜纸包裹 , 挤掉多余的 CSPD ready-to-use, 使其均匀平铺在膜上 , 没有气泡 , 但避免使膜干掉 . 室温孵育 5min.
15) 在37 oC 孵育潮湿的膜 10min, 增强发光 .
16) 用 X- 光底片将杂交膜进行曝光 10-25min.
    ( 发光性能至少可持续 48 小时 )
17) X- 光底片的冲洗
    Agfa 30 显影液显影 (1-5min)--- 冲水 (1min)---F5 定影液定影 (10min)--- 用水冲洗 --- 晾干底片

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