Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法.其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号.通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度.该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中.但由于该技术的操作比较烦琐、费时,所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交.但该技术也有它的独特之处,是目前其他方法所不能替代的,如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等.

一、基因组DNA的制备（前述）

二、基因组DNA的限制酶切
　　根据实验目的决定酶切DNA的量.一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA.购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液,并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度.为保证消化完全,一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA.消化的DNA浓度不宜太高,以0.5μg /μl 为好.由于内切酶是保存在50%甘油内的,而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用,所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10.
    具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入
      DNA（1μg /μl）              20   μg
      10×酶切buffer                4.0 μl
      限制性内切酶（10U/μl）        5.0 μl
      加ddH2O                    至 500  μl
    在最适温度下消化1-3hr.消化结束时可取5μl电泳检测消化效果.如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6hr已没有必要.或者放大反应体积,或者补充酶再消化.如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降.
   消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA,以终止消化.然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解（参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失）.
   如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化.

三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
    琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法,制备简单,分离范围广（200bp-50kb）,实验成本低.下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围.  
            表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围
    琼脂糖凝胶浓度（%）    分离DNA片段范围（kb） 
               0.3                        5-60
               0.6                        1-20
               0.7                       0.8-10
               0.9                       0.5-7
              1.2                        0.4-6
              1.5                        0.2-3
              2.0                        0.1-2
1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%.
2.  电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNA Marker.1-2V/cm,DNA从负极泳向正极.电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳.取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果.在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片.正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度.


四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物
    转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上,形成固相DNA.转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交.常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法.这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）.
（一）试剂准备
１．变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl.
２．中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;
３．转移液（20×SSC）： NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g,NaOH 调pH 至7.0,加ddH2O至1000ml.
（二）操作步骤
1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min.
2.中和:将凝胶转移到中和液15min.
3．转移  按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记,水浸湿后,浸入转移液中5min.剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥,再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用.按下图所示进行转移.（转移过程一般需要8-24hr,每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾.转移液用20×SSC.注意在膜与胶之间不能有气泡.整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物.）
4. 转移结束后取出NC膜,浸入6×SSC溶液数min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒,置于两张滤纸之间,80°C烘2hr,然后将NC膜夹在两层滤纸间,保存于干燥处.

五、探针标记
   进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记.放射性标记灵敏度高,效果好；地高辛标记没有半衰期,安全性好.这里介绍放射性标记.
   探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法,有一些试剂盒可供选择,操作也很简单.
   以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：
1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中,100℃变性5min,立即置冰浴.
2．在另一个0.5ml离心管中加入：
       Labeling 5×buffer               10μl
      （含有随机引物）
       dNTPmix                           2μl
       (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)
       BSA（小牛血清白蛋白）              2μl
       [a-32P]dATP                       3μl
       Klenow酶                          5U
3．将变性模板DNA加入到上管中,加ddH2O至50μl,混匀.室温或37℃ 1hr.
4．加50μl 终止缓冲液终止反应.
   标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用.由于a-32P的半衰期只有14天,所以标记好的探针应尽快使用.探针的比活性最好大于109计数/分/μl.

六、杂交
    Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式,即探针为液相,被杂交DNA为固相.杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度,可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动.杂交液可以自制或从公司购买,不同的杂交液配方相差较大,杂交温度也不同.下面给出的为一杂交液配方：
    PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺.该杂交液的杂交温度为42℃.
1．预杂交
    NC膜浸入2×SSC中5min,在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可）,将膜的背面贴紧杂交瓶壁,正面朝向杂交液.放入42℃杂交炉中,使杂交体系升到42℃.取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min,迅速加到杂交瓶中,使其浓度达到100μg/ml.继续杂交4hr.鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点,降低杂交背景、提高杂交特异性.
2．杂交
    倒出预杂交的杂交液,换入等量新的已升温至42℃的杂交液,同样加入变性的鲑鱼精DNA.将探针100℃加热5min,使其变性,迅速加到杂交瓶中.42℃杂交过夜.


七、洗膜与检测
   取出NC膜,在2×SSC溶液中漂洗5min,然后按照下列条件洗膜：
    2×SSC/0.1% SDS,42℃,10min；
    1×SSC/0.1% SDS,42℃,10min；
    0.5×SSC/0.1% SDS,42℃,10min；
    0.2×SSC/0.1% SDS,56℃,10min；
    0.1×SSC/0.1% SDS,56℃,10min.
   在洗膜的过程中,不断振摇,不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度.实践证明,当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时,是洗膜的终止点.上述洗膜过程无论在哪一步达到终点,都必须停止洗膜.洗完的膜浸入2×SSC中2min,取出膜,用滤纸吸干膜表面的水份,并用保鲜膜包裹,注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡.将膜正面向上,放入暗盒中（加双侧增感屏）,在暗室的红光下,贴覆两张X光片,每一片都用透明胶带固定,合上暗盒,置-70℃低温冰箱中曝光.根据信号强弱决定曝光时间,一般在1-3天时间.洗片时,先洗一张X光片,若感光偏弱,则再多加两天曝光时间,再洗第二张片子.
   影响Southern杂交实验的因素很多,主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等.

八、注意事项
1.     要取得好的转移和杂交效果,应根据DNA 分子的大小,适当调整变性时间.对于分子量较大的DNA片段（大于15kb）,可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤.
2.     转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透,否则会影响转膜效果；不可用手触摸NC膜,否则影响DNA的转移及与膜的结合.
3.     转移时,凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严,防止在转移过程中产生短路,影响转移效率,同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡,以免影响转移.
4.     注意同位素的安全使用.

相关阅读：
影响限制性内切酶活性的因素
一项DNA新发现有望大幅改善干细胞治疗的安全性
Southern 杂交一般操作
内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳