（一）原理： 

    细胞凋亡是一个受基因调控的主动过程,bcl-2是抑制细胞凋亡的原癌基因,正常细胞的激活和发育过程中都有表达,但在发育成熟的细胞中,其表达降低,在低分化或癌变的细胞中,bcl-2高表达与肿瘤的发生、发展相关,bcl-2过量表达常导致对化疗药物的耐药性而阻止细胞凋亡,影响治疗效果,一旦细胞发生凋亡,其bcl-2表达降低,甚至完全消失. 

    bcl-2家族由bcl-2、bcl-X、bax、mcl-1和A1组成.进行bcl-2基因表达的检测有两种,一种是用抗bcl-2蛋白抗体的流式细胞仪测定法,检测细胞浆中的bcl-2蛋白量,另一种是采用RT-PCR法测细胞中bcl-2 mRNA的表达. 

（二）方法： 

1、bcl-2蛋白表达的检测： 

    采用流式细胞仪和间接免疫荧光法测定细胞中bcl-2蛋白的量. 

  l 收集药物不同剂量、不同作用时间的凋亡肿瘤细胞,用含2%小牛血清的PBS洗2次. 

  l 加入2%多聚甲醛室温固定20min,再用PBS配制的Staing缓冲液洗涤. 

  l 1500r/min离心5min,弃上清,置-20℃存放过夜. 

  l 在冻存的细胞内加入1mlPBS配制的TB穿透液放置5min,用Staing缓冲液洗涤1次后,加2%灭活的人AB型血清1ml,37℃放10min. 

  l 加入bcl-2多抗工作液40ul,4℃孵育30min后,对照组不加多抗,随后用PBS洗3次,5min 1次. 

  l 加入FITC荧光标记的二抗工作液40ml4℃孵育30min后,用PBS洗3次,用流式细胞仪检测荧光强度（MFI）的变化,计算bcl-2阳性细胞表达率和bcl-2蛋白表达的平均荧光强度. 

   
2、RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达： 

  （1）总RNA提取： 

  为了获得高质量的真核细胞mRNA,必须使用RNA酶抑制剂.操作过程中应避免RNA酶污染器材和试剂,因此所有剥离、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12h,然后用无菌的新鲜蒸馏水淋洗数次,塑料器材应采用高压蒸汽灭菌.玻璃器材应于180℃干烤4-6h,所有溶液配制用水均用已灭菌的新鲜蒸馏水配制,所用试剂要新开封的试剂,或无菌分装至已处理的容器中,操作时应戴⁶⁰Co辐照的一次性手套,并勤换,以避免环境中和操作时的RNA酶污染.提取总RNA,采用异硫氰酸胍一步提取法即可. 

  l 收集药物处理和对照组的肿瘤细胞,用PBS洗2次,冷藏5min. 

  l 加入变性液Solution D 1ml. 

  l 用4号针头抽打混匀,再加入0.1ml的3mol/L乙酸钠充分混匀,加80%饱和酚1ml,氯仿/异戊醇0.2ml,混匀后置冰上15min.