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λ噬菌体臂与外源基因组DNA片段的连接

发布时间 2010-01-23 浏览量 作者: 无 来源: 无

材料:
    缓冲液和溶液:
    ATP(10mmol/L)
    SM和SM+明胶
    酶和缓冲液:
    噬菌体T4 DNA连接酶
凝胶:
    琼脂糖凝胶(0.7%),用0.5*TBE,含有0.5ug/ml的溴化乙锭。
    核酸和寡核苷酸:
    适当大小的基因组DNA,用于载体克隆
培养基:
    LB或NZCYM琼脂平板
    LB或NZCYM顶层琼脂糖
专用设备:
    预置于47℃的加热仪或水浴
    预置于16℃的水浴
载体和菌株:
   λ噬菌体包装混合物
   λ噬菌体臂DNA
   大肠杆菌铺平板细菌
方法:
1、  建立含有如下物质的一系列连接反应。
    λ噬菌体臂                0.5-1.0ug
    部分酶切基因组DNA       6-1200ng
    10*连接缓冲液             0.5-1.0ul
    10mmol/L ATP(若必要)      0.5-1.0ul
    噬菌体T4 DNA连接酶      0.5-1.0ul
    水                        至5或10ul
    建立两个对照反应,其中载体和插入DNA任缺其一。将连接反应置16℃温育4-16h。
2、  在各连接反应中取10-25%组分,按照生产商提供的关于包装提供无的说明包装入λ噬菌体颗粒
3、  将包装反应进行10倍稀释(10-1-10-5),用SM+明胶或厂家推荐的相应缓冲液作为稀释液。
4、  如方案1所述,分析每个稀释度1ul和10ul所形成噬菌斑的数量。
5、  从得到感染性噬菌体颗粒最多的连接反应中,挑取6-12个噬菌斑,如方案23所述从每个噬菌斑制备小量重组DNA。
6、  用适当的限制酶消化,随后进行0.7%的琼脂糖凝胶电泳,并使用适宜的分子质量标准,检测所插入基因组DNA的大小。
7、  如果噬菌体是重组子且含有合适大小的插入片段,则通过建立多个连接和包装反应构建基因组DNA文库。在这些反应中插入片段和载体DNA的比值影视,在试反应中产生最多重组噬菌斑所采用的比值。
8、  估算大规模连接和包装反应所产生的所有重组噬菌斑的量,并计算如此大小的文库所能覆盖整个目标基因组的程度。


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