通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后,可以通过两种选择获得全长的cDNA.通过PCR和克隆的方法.
    通过PCR的方法获得全长cDNA ：
1、扩增长的cDNA需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物.
2、根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物.这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端,应该是23－28nt长.不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景.在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物.但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应.
3、进行如下的热循环：
    94度30秒
    25个循环：
（1）94度5秒
（2）72度2－15分钟
4、延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟.例如：预期得到6kb的条带,用6＋2＝8分钟的延伸时间.注意：如果没有条带或者条带弱,增加5个循环；或者优化PCR的条件.
5、在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品.通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的cDNA.
6、制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶.不使用TBEbuffer,TBE的胶很难制备全长的cDNA.
7、将剩下的45μl反应物点样,选用适当的marker.
8、利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA.注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射.
9、利用胶回收试剂盒回收cDNA.此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果.如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品.
10、将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中.
    通过克隆产生全长的cDNA：
1、如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物,同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话,通过克隆技术可以获得全长的cDNA.
2、利用酶切获得的3‘和5’扩增产物,并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来.利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中.
3、在哺乳动物基因组中,NOT1和Srf1酶切非常稀少,大约106bp才出现一次,因此在绝大多数的cDNA中是不出现的.
    RACE的扩增原理图


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