IOS下载  IOS下载
IOS下载二维码
手机扫描二维码
Android下载  Android下载
手机扫描二维码

GST-融合蛋白的表达与纯化

发布时间 2010-01-21 浏览量 作者: 无 来源: 无

原理:
    GST纯化系统是利用GST(glutathione-S-transferase)融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化.1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白,并可反复使用数次.试剂u IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 2g IPTG 溶解入10ml 水,过滤除菌,分装,-20℃保存.u Lysis buffer (50ml)1)2.5ml 1 M Tris,pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris,pH8.0 3)90ml distilled water .
操作步骤:
1) 挑一个克隆至2mlLB液中(Amp+)
2) 37℃振摇至OD600值约为0.6
3) 将2ml菌液加入100mlLB中
4) 37℃振摇至OD600值约为0.6
5) 加入IPTG至终浓度为1mM
6) 继续摇3~4h
7) 离心(5000 rpm,5min,4℃)
8) 用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌
9) 超声破碎细胞
10) 离心(12,000rpm,15min,4℃),取上清
11) 用滤纸过滤
12) 加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱
13) 5×柱体积的lysis buffer洗层析柱
14) 样品过柱
15) 5×柱体积的lysis buffer洗层析柱
16) 3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白
17)收集蛋白:0.5ml/管 18)取20ml样品SDS-PAGE鉴定可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂,防止蛋白的降解.

相关阅读:
利用细菌发明新型密码 不耐抗生素细菌将死亡
常用菌种保藏方法
代谢蛋白PKM2对肿瘤细胞有着意想不到的作用
甲基化对基因表达调控研究
一种蛋白质能抑制癌细胞形成扩散 仅限细胞核内
Nature文章:科学家发现果蝇体内主导病痛的蛋白质


 


回到顶部