几乎所有的分子生物学家在工作中都要遇到对克隆到诸如高容量载体黏粒载体、细菌人工染色体或P1噬菌体人工染色体等上的大量DNA片段进行测序的挑战.对长度超过几千个碱基的克隆DNA片段进行有效的测序需要使用高通量、自动化的DNA测序仪.如果使用这种设备,现在任何有实力的机构都可以进行繁重的测序工作,然而这在几年前还是大多数实验室所做不到的.
    大规模测序大多采用将随机断裂的靶区域小片段亚克隆到M13噬菌体载体上的“鸟枪法”策略.目的是构建一个重叠克隆文库,提供的克隆片段数至少超过全部靶片段的5倍.任何一个克隆在引物结合位点下游都含有一个随机的靶DNA片段,在DNA自动测序仪上,从引物结合位点起可测定600-800bp长的DNA序列.从文库中随机选取克隆进行测序,直到获得至少95%靶DNA的两条链的序列.对于间断和模糊不清的部分序列,采用直接测序的方式完成.收集存储的数据有计算机辅助处理拼接.有两种方法可用于切断双链DNA以获得长度适于鸟枪法测序的DNA片读.
    机械剪切：可以用不同的方法产生机械剪切力.一般情况下,在曳力的作用下使双链DNA分子展开,然后在双链DNA分子中心区断开磷酸二酯键骨架,由曳力导致DNA断裂.由于断裂易于发生在DNA分子中心区,原始DNA分子的末端在由机械剪切法制备的鸟枪文库中难以得到充分的体现.这个问题可以通过在机械剪切前将DNA串联起来得以减轻.
    酶切割：在Mn2+存在下,活在没有单价阳离子时,高浓度的DNA酶I可以在双链DNA的两条链详尽的位置同时切割DNA.在此条件下,酶几乎不显示序列特异性,能以相同的速率切割DNA分子的所有区域（末端核苷酸除外）.因此,由DNA酶I消化产生的DNA片段大小分布范围较广,但只有一部分片段适合于克隆和测序.
    直到现在,很少用限制性内切酶制备鸟枪法测序用DNA片段.因为用单一限制酶完全消化DNA不能那个产生重叠片段,需要用几种不同的限制酶消化构建不同的文库才能产生重叠片段.由于DNA分子上的酶切位点很少,部分消化所构建的鸟枪文库也不具优势.然而,随着CvjJ I切割DNA序列PyGCPy和PuGCPu产生平末端片段的发现,这一问题已得到解决.在这种“宽松条件下”,DNA上每16-64个碱基就有一个潜在的酶切位点.用CvjJ I部分消化黏性载体大小的DNA产生约1千碱基的DNA片段含有许多潜在的位点,并且偏性很小.
    DNA测序的许多方面都已经自动化了.例如,使用机器人工作站进行双脱氧测序反应和自动读取并传送荧光标记的序列数据到计算机.有关这一方面进展的综述请参见信息栏有关DNA自动测序部分.
    下面的方案描述了鸟枪法测序的起始步骤,从靶DNA的剪切到用M13噬菌体载体构建DNA片段文库,也包括断裂靶DNA的两种方法——超声法和喷雾法,以及用DNA聚合酶修复片段某段的技术要点.然后,用琼脂糖凝胶电泳按大小分离DNA片段,从凝胶上回收DNA片段,并将其连接到M13噬菌体载体上.连接产物转染适当的大场杆菌,构建重组M13噬菌体克隆文库.按Zollo和Chen介绍的方法从生长于96孔板的耽搁克隆中制备单链DNA模板.接下来的方案介绍了如何从文库中随机选取克隆作为双脱氧链末端终止测序反应的模板,以及如何进行DNA测序和序列的拼接.
材料：
缓冲液和溶液：
    乙酸铵（10mol/L）,ATP(可选用,参见步骤1),乙醇,甘油（无菌,100%）,水（去离子蒸馏水）,IPTG,MgCl2,NaCl
    酚（Ph7.6 Tris 饱和）
    酚：氯仿（1：1,m/V）
    聚乙二醇（30% m/V  PEG 8000）(可选用,参见步骤1)
    聚乙二醇（20% m/V  PEG 8000）
    TE（PH7.610*TM缓冲液
    0.5mol/L Tris-HCl(PH 8.0)
    150mmol/L MgCl2
    TTE缓冲液
    含0.5%Triton X-100 TE(PH 8.0)
    X-gal


酶和缓冲液：
    T4噬菌体DNA连接酶
    T4噬菌体DNA聚合酶
    T4噬菌体多核苷酸激酶
    大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段
凝胶：
    琼脂糖凝胶（两种1%和一种0.7%）
    聚丙烯酰胺凝胶（中性,5%聚丙烯酰胺）或琼脂糖凝胶（0.8%低熔点琼脂糖）
    核酸和寡核苷酸：
    λ噬菌体DNA或φX174DNA用AluI[1ug Alu I,溶于20ul TE (ph7.6)]酶解后,用等体积酚：氯酚抽提DNA,去除限制性内切核酸酶.乙醇沉淀DNA重溶于TE（ph7.6）中,按步骤13测试酶解DNA与去磷酸化、线形话载体的连接效率.如果使用商品化的载体就不需要消化DNA了.
DNA分子质量标准：
    适当大小的的DNA分子质量标准,如Life Technologies公司用Sau3A  I消化的p UC 18或p UC 19,或相差123bp的梯度分子质量标准；New England Biolabs 用HaeⅢ消化的φX174DNA
dNTP溶液：
    含有4种d NTP,每种浓度为2.0mmol/L
靶DNA：
    靶DNA制备通常由用限制酶消化高容量载体（如：黏粒载体、BAC、PAC或PI）构建的重组体获得.所用限制酶的酶切位点应在克隆片段的序列中不存在.如果可能尽量使用能产生黏性末端的限制性酶,这可以简化纯化的靶DNA的连接（步骤1）.靶DNA片段从载体中酶切下了后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化.用TE（PH7.6）溶解纯化的DNA,浓度为1mg/ml.取DNA溶液（50ng）,用琼脂糖凝胶电泳检查DNA的完整性和回收率.
培养基：LB或含有5mmol/LMgCl2 的2*YT培养基
     顶层琼脂糖
     YT琼脂平板
离心机和转子：
    转速3000r/min离心深孔微量板和标准微量滴定板的离心机.
    例如配备微孔板架的贝克曼GPR离心机,配备摆式转头（M4型）和微孔板架Jouan CR422型离心机.
专用设备：
    深孔微量板、盖、帽
    唯恐要能容纳1-1.2ml,并能经受住3000r/min的林欣.如96孔平底板和盖子.此外,还有配有单片盖和帽的贝克曼96管盒.制备96个M13噬菌体模板需要两盒配有盖和帽的管.
    微量滴定板（96孔,配有合适的盖）
    多头移液器（8或12个头）
    多管涡旋振荡混合器
    银色胶带（3M公司产品）或相应物品
    胶带必须确保96管盒密封不漏水.
超声仪和喷雾器：
    关于超声,可以用微型探头超声仪或杯-角型超声仪,有两点理由：1.DNA置于微量离心管中,体力通常只有20-25ul；2.因为杯-角型超声仪探头不接触DNA溶液,没有污染.
    牙签
    可调节16℃、37℃、68℃和80℃的水浴.
载体和菌株：
    M13噬菌体载体DNA,包括蓝白筛选、线性化、平末端和去磷酸化的载体DNA.
    这些种类的预制载体可以从公司购得,也可以按照本方案后面提供的附加方法制备.
    适当菌株的大肠杆菌感受态细胞（如XL1F’-Blue、DH5αF’）：
    高效的大肠杆菌感受态细胞（>109转染子/ug闭环载体DNA）对获得高丰度的靶DNA库是十分重要的.预制备的高校大肠杆菌感受态细胞可以从公司购得,也可参照第一章的方法23-26制备.如果还能用电转移仪,我们推荐使用电转大肠杆菌感受态细胞,可以获得高效转化.


方法：
靶DNA自身连接：
    自身连接时确保靶DNA末端序列在构建文库的片段中有足够的量所需要的.
    将5-10ug纯化的靶DNA加入一只干净的离心管中,并加入：
    10*T4噬菌体DNA连接酶缓冲液           2.5ul
    5mmol/L  ATP                                           2.5ul
    30% m/V PEG8000（可选加）               5.0ul
    T4噬菌体DNA连接酶                            0.5-2.0Weiss单位
    H2O                                                         至终体积25ul
    混合液于16℃温育4h,然后与68℃加热15min使连接酶失活.
    如果靶DNA是平末端,在反应中加入PEG可以提供连接效率.黏末端连接,连接酶用量为0.5Weiss单位；平末端连接,连接酶用量为2.0Weiss单位.
    有些商品连接酶缓冲液中含有ATP,此时无须添加ATP.
    加入175ulTE(ph7.6),用酚：氯仿抽提以纯化连接好的DNA.用2mol/L乙酸铵和3倍体积乙醇沉淀DNA,用微量离心机以最大转速离心5min,回收DNA.于室温用0.5ml70%乙醇洗涤沉淀,在此离心.
    尽可能取出上清液,在室温下使最后残留的痕量乙醇挥发殆尽.在微量离心管中加入25ulTE（ph7.6）溶解DNA.
靶DNA的断裂：
    下列方法是Birren等方法的改进
    用超声处理或喷雾处理使靶DNA断裂为0.8-1.5kb长的片段
超声断裂DNA：
    在超声仪的角杯中注满冰水,打开超声仪开关,设置好时间,功率设为10,用两种40秒脉冲预热超声仪
    冰水可以防止DNA变性,超声不同样品钱最好更好角杯中的冰水.
    将装有DNA的离心管放置于冰水中,离心管的底部敲好高于角杯探头中心孔1-2nm,超声处理DNA.
    通过超声处理实验样品DNA,并用步骤4描述的方法分析超声结果,确定最适超声处理条件.对于大多数DNA样品,功率设为3,两次6秒脉冲主要产生500-2000bp大小的片段.
    快速离心使超声处理的DNA溶液沉积于离心管底部,并置于冰上.
    取1ul超声处理的DNA样品盒适当大小的DNA分子质量标准,用0.7%琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段大小.电泳时余下的DNA样品仍放置在冰上.
    如果得到的DNA片段大小不合适,改变超声条件,再次进行超声处理.如果得到的DNA片段大小合适,继续按步骤5所述进行DNA末端修补.
喷雾断裂DNA：
    准备如下DNA溶液,并置于喷雾杯中.
    DNA样品（来源于步骤3）                     5-10ug
    10*TM缓冲液（PH 8.0）                         200ul
    无菌100%甘油                                          1ml
    无菌水                                                    至终体积为2ml
    将DNA样品置于冰浴中,依据经验用最适条件喷雾处理DNA样品.
    DNA片段的大小主要决定于氮气的压力.例如 8psi （0.56kg/cm2）压力处理黏粒载体DNA主要产生1000-2500bp大学的片段.对一个新的靶DNA的最适喷雾压力盒喷雾时间要依据经验确定.同超声处理异议,冰水浴可以防止DNA降解,同事对产生大小均匀的DNA片段有重要作用.
c..将喷雾器置于合适的离心机转头中,用聚苯乙烯泡沫塑料做衬垫.于4℃ 2000g（配备微孔板放置装置的离心机用1000r/min）快速离心使样品DNA溶液沉积于喷雾杯的底部.
d．将DNA样品溶液分为四份,转入1.5ml离心管中,按标准方法乙醇沉淀DNA,真空干燥DNA沉淀.
e．用35ul TE（ph7.6）溶解每一份DNA沉淀,取1ul喷雾处理的DNA样品盒适当分子质量大小的DNA分子质量标准,用0.7%琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段大学.电泳时余下的DNA样品4℃保存.
    如果得到的DNA片段大小不合适,改变喷雾条件,再次进行喷雾处理.如果得到的DNA片段大小合适,继续按步骤5所述进行DNA末端修补.
    DNA的修补、磷酸化和大小选择：
    喷雾处理和超声处理产生的DNA末端是高度不均一的,包括平末端和残损末端、带有磷酸集团和不带磷酸集团的末端.因为在这些分子中只有一部分能被DNA聚合酶修补,流体静力剪切的DNA克隆到M13噬菌体的效率通常较低.不过超声处理5-10ug靶DNA,通过修补和选择大小适当的片段,一般能形成几千个重组克隆.
    在打断的DNA（约25ul）中,加入
    10*T4噬菌体DNA聚合酶缓冲液                    4.0ul
    2.0mmol/L 含四种d NTP溶液                           4.0ul
    T4噬菌体DNA聚合酶                                      5单位
    水                                        至终体积40ul
    于室温温育15min,然后后加入约5单位      Klenow片段,继续于温室温育15min.
    该反应使用两种DNA聚合酶修补由于流体静力剪切产生的DNA片段的残损末端.T4噬菌体DNA聚合酶补平3’凹端,并且其外切酶活性可去除突出端.Klenow片段提供了第二种补平3’凹端的工具,有关内容可参考信息栏“大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段”部分.
    用酚：氯仿抽提纯化DNA.上层水相转移到一个干净试管中,是NaCl浓度达到0.1mol/L,加2体积乙醇,回收沉淀DNA.用70%乙醇洗DNA沉淀.
    加入25ulTE(PH7.6)重新溶解沉淀DNA.
    在微量离心管中混合如下组分：
    打断的DNA                                      23ul
    10*多核苷酸激酶缓冲液                            3ul
    20mmol/L  ATP                                   3ul
    T4噬菌体多核苷酸激酶                            1单位
    T4噬菌体多核苷酸激酶催化平末端DNA5’端磷酸化,此步骤不是必需的,但是一般情况下可以提供DNA片段与载体的连接效率.
    于37℃温育30min
    用0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳或5%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳（参见第五章）纯化所需大小（0.8——1.5kb）DNA片段.
    为最大限度地减少污染的可能性,应在断裂靶DNA和标准参照物之间空出几个泳道,这一点在使用平端DNA作为参照物时尤为重要,因其与载体DNA的连接笑了明显高于剪切的靶DNA.
    用第五章描述的方法从凝胶上回收靶DNA.用25ulTE(PH7.6)溶解纯化的DNA.
    取1ulDNA用1%琼脂糖凝胶电泳分析所纯化DNA的完整性和回收率.


与载体DNA连接：
    设立一系列实验连接反应,其中含有50ng（——0.01pmol）线性化和去磷酸化载体DNA及浓度递增的平端、磷酸化的靶DNA片段.
    连接液通过电转移或转化适当菌株的大肠杆菌感受态细胞.于细菌铺于含IPTG和X-gal的培养基上,37℃过夜.
    这一步骤的目的在于找出一个靶DNA片段的浓度,以便最大限度地减小含有认为融合的靶片段的重组体,而后者会使测序更为复杂.因此,当确定大量的连接反应时（步骤16）,必须注意避免使用饱和量的靶DNA.相反,所定出的靶DNA量应为重组克隆的数目与背景相比有中等程度的提高（大约提高至5倍）.
    次日计数蓝噬菌斑和白噬菌斑的数目.
    采用断裂的平端靶DNA所得的重组体数目大约仅为采用限制性内切核酸酶制备的平端DNA所得数目的十分之一（例如同用Alu I消化的λ或φX174DNA作为起始连接反应相比）.
    用最小量的断裂平端靶DNA设立一个较大规模的连接反应,以便获得足够的重组克隆完成测序任务.用连接的DNA转换大肠杆菌,37℃培养过夜.
    这一步骤的目的在于确保每个靶片段至少获得五个重组克隆.
    次日收集平板,将转化子保存在适当条件下备用.从一系列单个噬菌斑中制备DNA模板的方法见第三章的方法4.
    M13重组噬菌体噬菌斑应尽快跳出和扩增.因为噬菌体颗粒可以在顶层琼脂中扩散至较远距离,在37℃生长长时间(>12-16小时)的噬菌斑或者在4℃存放数天的噬菌斑往往已被污染.因此使用从时间较久的噬菌斑制备DNA进行测序反应时,背景带的强度和数目都有所增加.
用96管盒培养M13噬菌体重组克隆：
    按第三章的方案2所述方法挑取单一无色噬菌斑,接种在含有2ml希冀培养基的15ml试管中进行培养.然后分别回收各重组病毒颗粒,纯化DNA.由于每次只能处理12或24个克隆,模板纯化过程费时且繁琐.大规模的DNA测序需要成千上万的DNA模板,但采用有机溶剂抽提和多步离心方法不能快速、经济地制备单链DNA模板.取而代之的M13噬菌体模板大量制备方法通常包括噬菌体颗粒的纯化或结合自动化技术设备用过滤法、磁珠法或顺磁珠法纯化单链DNA.但是这些设备和操作设备所需的工作人员是一般学术机构所不具备的.不过Zollo和Chen报告了一种用于在96孔板中培养M13噬菌体克隆,并制备单链DNA的有效可重复的方法,满足了基于荧光的自动化DNA测序仪对大量模板的需求.
    在鸟枪法测序中,使用一次性平底孔板或一次性试剂组盒,以少量细菌培养物培养M13噬菌体重组子,同时处理96个样品是非常有效地.所有单链DNA模板制备有关的后续步骤都可以在同一块板中进行,减少了一步又一步转移克隆的工作量,使一个研究人员可在一天内制备960个或更多的DNA没摸过.
    对96个克隆,每一个克隆都逐一地将大肠杆菌F’菌株（如XL1-Blue、XL1-Blue MRF’或DH5αF’）的单一菌落接种到100mlLB或2*YT培养基,并加至容量为500ml的培养瓶中.于37℃以300r/min振荡6-8h.
    在培养液中加入MgSO4至终浓度为5mmol/L
    为了保持离心石的平衡和对称,培养的M13噬菌体的克隆数为96的偶倍数.
    Mg2+能提高M13噬菌体产量,并降低不同颗粒间生长速度差异.
    每组96个M13噬菌体克隆均需要80ml培养细胞.
    用多道移液器转移0.8ml细胞培养液至96管盒的各管中.
    带上手套,用无菌牙签仔每一个96管盒的各管中接种单一无色的M13噬菌斑.用牙签穿刺噬菌斑的重要,然后投入培养管中.
    为避免造成混乱,将牙签保留在培养管中知道所有的96个培养管都接种完毕.
    当最后一个噬菌斑挑取完成,取出所有牙签,封闭培养管盒.培养管盒做好标记,放入37℃摇床中,以250-300r/min振荡培养8-12h.如果需要可重复步骤20和21.
    如果培养时间超过12h,制备的单链模板将会被大量的M13噬菌体双链复制型DNA和/或染色体DNA所污染.来源于细菌裂解产生的DNA将加大双脱氧测序反应中错配引物的机会.长时间培养也将加大DNA克隆片段确实和重排的机会.因此,适当短时间培养是本方法成果的关键.


M13DNA的纯化：
    从培养箱中取出培养管盒,2400g（带有微量板套筒的离心机转速为3000-3250r/min）离心20min沉淀菌体.
     M13噬菌体克隆的主要保存方法是在50ul悬液中加入25ul 80%的甘油,用微量加样器上下吹打混合溶液,贮存板保持于-80℃.如果需要再制备模板DNA,这些班作为感染用的噬菌体来源.本方案最后要强调的是要安全的保存噬菌体,在本方案中各管间有较大的交叉污染的可能,这对DNA测序影响不大,但对于种源的保存时不能接受的.
    用多道移液器在心的96管盒的各管中加入120ul含20%PEG 8000的2.5mol/L NaCl溶液.
    从离心机消息取出离心管,用多道移液器从个管中分别吸取0.6ml上清液加入到已加有PEG/NaCl溶液的各管中.
    重要：这本步骤中一定不要搅动菌体沉淀,混有菌体将显著降低DNA测序质量.
    用96管盖盖上装有噬菌体悬液和PEG/NaCl溶液的试管,确保形成牢固的液封,颠倒试管几次,以混合内容物.试管盒室温放置30min,然后冰浴30-60min.2400g（带有微量板套筒的离心机转速为3000-3250r/min）离心30min,收集沉淀噬菌体.取出各排试管,倒置与水槽上空干,在每只试管底部可见白色沉淀.将试管放回试管盒.
    将所有试管被空干,将试管盒倒置在吸水纸上几分钟空干残存的痕量液体.重新换上新的吸水纸,将导致的试管盒与吸水纸放入离心机中,以300r/min离心3-5min,去除最后残存的痕量PEG/NaCl溶液.
    从离心机取出试剂盒,检查试管底部是否仍有噬菌体沉淀.美观加入20ulTTE缓冲液.
    如果噬菌体生长良好,沉淀呈白色不透明状；如果生长不好,沉淀呈带点蓝色不透明状.如果沉淀呈褐色团块,很可能是因为在步骤26取菌体量过多.棕色成点制备的模板测序所得结果欠佳.
    用3M银色胶带密封试管口,在多管旋涡振荡器中剧烈振荡试剂盒15-30min.
    快速离心试管盒使液体沉于官邸.去掉每一个96孔管盒底座,将试管置于8.℃水浴中加热10min.
    该步骤是为了裂解M13噬菌体颗粒.取得管盒的底座可以确保所有的试管在80℃保温达到10min.
    从水浴中取出试管并冷却至室温.重新安上试管盒底座,快速离心试管盒使液体沉于管底.
    用多道移液器将70ul无菌水加到96孔板的各孔中,将步骤33获得的噬菌体裂解液转移到96孔板中,用移液器吹打混匀两种溶液.用一条3M银胶带密封96孔板,如果在24-48h进行测序也可以用96孔板盖板盖住.标记好各块板,贮存于-20℃.
    每进行一次培养可以提取到2.5-5ug M13噬菌体单链DNA.
    随机从一些孔中取DNA样品（5ul）,用1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA量.
   如果一切正常,各管中的DNA产量差别很小.DNA循环测序反应一般需制备DNA量为2ul-7.5ul.