目的意义:
    DNA 是遗传信息的载体和基本遗传物质,它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用,是分子生物学和基因工程研究的对象,但无论是 研究植物 DNA 的结构和功能,还是开展外源 DNA 的转化、转导的研究,首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化 DNA .因此,本实验的目的是学习植物基因组DNA 提取方法、原理和 DNA 的鉴定技术.

(一)、植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）:
一、原理:
    植物组织中绝大部分是核 DNA ,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起,以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内. CTAB( 十六烷基三甲基溴化 铵, hexadecyltrimethylammonium bromide ,简称 CTAB) :是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中 (0.7mol/L NaCl) 是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度 (0.3mol/L NaCl) 时从溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙 醇使核酸沉淀, CTAB 能溶解于乙醇中.
    在 DNA 提取过程中必须始终注意以下几个关键问题:
(1) DNA 的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开,即“变性”,因此抽提时避免使用变性的条件.
(2)抑制内外源 DNase 的活力. DNase 就象一把刀,它能把大分子的 DNA 切成碎片,所以要加以杜绝,现可以通过多种途径来做到这一点: a 、低温操作； b 、调节 pH ,使偏碱(pH8.0)； c 、抽提液中加表面活性剂； d 、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+),使酶活性丧失.
(3)防止化学降解.如过酸或过碱以及其它化学因素,会使 DNA 降解,一般综合考虑,取 pH8.0 左右为宜.
(4)防止物理因素降解.如温度太高或机械张力剪切等, DNA 分子特别大,其分子量可达 1012 道尔顿,极易被机械张力拉断,甚至在细管中稍急一些的流动也会使 DNA 断裂,所以在抽提过程中要特别注意这一点,操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数,也不要剧烈摇动.
(5)植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用.因此,一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA 的材料,这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少, DNA 含量高,且易于破碎,植物材料最好是新鲜的.
    分离提取植物 DNA 的方法很多,本实验采用 CTAB 法提取 DNA 并通过紫外吸收法和电泳鉴定.
二、实验材料、仪器及试剂:
1 、仪器
水浴锅:混匀器；高速冷冻离心机；移液器； 754 紫外分光光度计；液氮罐；水平电泳槽；电泳仪
2 、材料与药品
水稻幼苗 ；液氮；吸头、小指管；氢氧化钠；溴代十六烷基三甲胺 (CTAB) ；三羟甲基氨基甲烷 (Tris) ；氯仿；乙醇； RNA 酶；蔗糖；溴酚蓝；异戊醇； β- 巯基乙醇；盐酸 (HCl) ；异丙醇；乙二胺四乙酸 (EDTA)
3 、试剂
(1) DNA 提取液:
    100mmol/L Tris,
    20mmol/L EDTA,
    20g/L NaCl
    1.4mol/L NaCl
    pH8.0


(2)异丙醇 (-20 ℃ 预冷 )
(3)溶液 I :氯仿异戊醇 (24 : 1)
(4) 5×TBE 缓冲液
    0.45mol/L Tris·H3BO3
    0.5mol/L EDTA(pH8.0)
(5) TE 缓冲液
    10mmol/L Tris·HCI
    1mmol/L EDTA(pH8.0)
(6) 75% 乙醇 ( 放 -20 ℃ 冰箱中,用后即放回 )
(7) RNA 酶
    将 RNA 酶溶于 10mmol/L Tris·HCI(pH7.5) 、 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/mL 的浓度,于 100 ℃ 加热 15 分钟,缓慢冷却至室温,保存于 -20 ℃ .
(8)上样缓冲液: 40% 蔗糖、 0.25% 溴酚蓝
三、操作方法:
(1)取 200mg 样品 ( 在液氮中研磨成粉末状 ) 放入 1.5mL 离心管中,加入 600μL DNA 提取液,颠倒混匀 5-6 次. 65 ℃ 保温 35 分钟以上,其间颠倒混匀一次.
(2)再加等体积的氯仿异戊醇 (24 : 1) 溶液轻轻摇晃 30 秒,在 4 ℃ 下 10000rpm/ 分钟离心 10 分钟后,取吸上清液 (450μL)
(3)再加两倍体积的预冷异丙醇,混匀静止 10 分钟以上,在 4 ℃ 下 10000rpm/ 分钟离心 10 分钟后,弃上清.
(4)用 600μL70% 乙醇洗涤沉淀,重复一次,在室温下倒置晾干.
(5)沉淀用 TE 溶液溶解 DNA ,再加入 RNase 至终浓度 50μg/mL ,在 37 ℃ 下保温半小时,将 DNA 样品放入冰箱保存.

(二)、 植物 DNA 纯度的鉴定 —— 紫外分光光度计法
一、 原理:
    由于核酸中的碱基都具有共轭双键,所以具有紫外光吸收性质.核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线,其吸收高峰在 260nm 处,吸 收低谷在 230nm 处.蛋白质在紫外区的吸收高峰在 280nm 处,所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一.但紫外法不能区分 DNA 和 RNA ,只能用来鉴定核酸的纯度和含量.
    纯度鉴定时,需测定在 230 、 260 和 280nm 处的消光值,经验数据表明,纯净的核酸溶液 A260/A230 的消光值比大于或等于 2.0 ； A260/A280 大于或等于 1.80 . A260/A280 值过小,说明蛋白未脱净； A260/A230 过小,说明有杂质（一般为多酚类或色素）.
    含量测定时,对于纯净的 DNA 来说,在实际应用中可根据 260nm 处的消光值 O.D260 值换算成含量,一般认为 O.D260 值为 1 时,相当于 50μg/ml .在测定核酸粗制品时,样品中残留的蛋白质和色素等与其它具紫外吸收的杂质对测定有明显干扰作用,大分子核酸制备过程中变性降解后有增色效应,因此有时此法测定的结果会高于定磷法.
二、实验材料、仪器及试剂:
1 、材料 : 植物 DNA
2 、器材:紫外分光光度计、移液管、试管
3 、试剂: TE 溶液(pH8.0)（见前述）
三、操作方法:
    将纯化的 DNA 溶液用 TE (pH8.0)稀释至每毫升含 5-50μg DNA 浓度范围,用 TE (pH8.0)作空白对照,于紫外分光光度计上测定 260nm 、 280nm 和 230nm 吸收值,计算 A260/A230 和 A260/A280 的比值,并换算出核酸的含量.


(三)、植物 DNA 分子量的测定 —— 琼脂糖凝胶电泳法
一、原理:
    以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛应用于核酸研究中,其操作简单、快速,是分离、鉴定、纯化 DNA 的标准方法. DNA 分子在高于其等电点的 pH 溶液带负电荷,在电场中向正极移动. DNA 分 子在电场中通过凝胶介质而泳动,除电荷效应外,还有凝胶介质的分子筛效应,也就是说与分子大小构象有关.实验表明 DNA 迁移率与其分子量的对数成反比.因 此通过参比已知标准分子量的 DNA 迁移率,可测定样品 DNA 的分子量.用低浓度的荧光物质,插入性染料溴化乙锭(EB)使凝胶中 DNA 区带染色,在紫外光 下可直接显示 DNA 在凝胶中的位置,灵敏度很高,可检出 10ng (10-9g)或更少的 DNA 含量.
二、实验材料、仪器及试剂:
1 、材料:植物 DNA
2 、器材:水平板型电泳槽装置 ； 电泳仪 ； 254nm 波长的紫外分析仪；塑料手套；移液管；水浴锅
3 、试剂:
(1) T ris-HAc(TAE) 缓冲液: A ．浓缩的贮备液(50 倍）每升含: 242gTris 57.1ml 冰醋酸, 100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0). B ．使用浓度: 0.04mol/L Tris-HAc/0.04mol/L EDTA .
(2)琼脂糖:电泳纯以上.
(3)溴酚蓝甘油溶液(0.05% 溴酚蓝 -50% 甘油溶液）:先配制 0.1% 溴酚蓝水溶液,然后取 1 份 0.1% 溴酚蓝溶液与等体积的甘油混合即成.
(4)已知分子量的标准 DNA (λDNA-ECORI/Hind III).
(5) 10mg/mL 溴化乙锭水溶液(EB)或 GV 水溶液.
三、操作方法:
1、琼脂糖凝胶板的制备:
    称取 0.7g 琼脂糖置于三角瓶中,加入 100mlTAE 缓冲液,在沸水浴中加热至琼脂糖完全溶 解,冷却至 50 ℃ ,然后加入 EB 溶液使终浓度为 0.5μg/ml .倒入凹形有机玻璃槽（事先用胶带封住有机物玻璃板的边缘）.使其成 2mm 左右的凝胶板. 在其未凝固前将样品槽模板（梳子）插入凝胶的一端,注意梳齿底与凝胶底之间应至少保持 0.5-1.0mm 的凝胶.待全部凝固后（室温,约 30-45 分 钟）,取出梳子及除去胶带,将凝胶板与玻璃板一起放入电泳槽内,加入 TAE 缓冲液使刚好超过凝胶面约 1mm .
2、加样:
    将样品与溴酚蓝按 4 : 1 的比例混合,用移液器缓慢加入凝胶样品孔中,点样量为每孔 5μgDNA .
3、电泳:
    点样端接负极,电泳开始时,可用较高的电压,如 100 伏特,这样可使样品很快进入胶内,而减少样品扩散,待样品进入胶内即可保持每厘米 5 伏特左右的电压, DNA 在电泳中向正极移动.当溴酚蓝的区带移至距凝胶底部 1-2cm ,停止电泳,当胶板为 10-15cm 的长度时,电泳时间一般为 2 小时左右.
4、观察与鉴定:
    电泳结束后,取出凝胶板,在波长为 254nm 的凝胶成像系统下,观察电泳图谱,如果电泳条带清晰 ( 如果 EB 染色看到桔黄色荧光条带, GV 染色则看到绿色荧光条带 ) ,将凝胶照相.根据标准 DNA 的电泳图谱,可以得知样品 DNA 的分子大小.
四、附注:
1 、溴化乙锭是一种很强的 DNA 诱变剂,接触含有该染料的凝胶或溶液时一定要戴上一次性塑料或者橡胶手套.
2 、电泳后的凝胶板,不能倒在下水道里,应做专门的处理.

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