用特异荧光染料（Hoechst33258）染色后在荧光显微镜下进行检测.荧光染料（Hoechst33258）是一种能和DNA特异结合的物质.如果检测样品为支原体污染,则附在细胞表面的支原体DNA着色,在荧光显微镜下可见.

1、仪器设备及制剂的配制：
    （1）仪器荧光显微镜,CO2培养箱,细胞培养六孔板或其他容器.
    （2）培养基：DMEM完全培养基及无抗生素的DMEM培养基.
    （3）试剂：
    ① 二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst33258）浓缩液：称取5mg二苯甲酰胺荧光染料,加入100ml不含碳酸氢钠的Hanks液中,室温下磁力搅拌30—40min,使其完全溶解,-2℃避光保存.
    ② 二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst33258）工作液：量取100ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks液,加入1ml二苯甲酰胺浓缩液混匀.
    ③ 固定液：乙酸：甲醇（1：3）混合液.

2、检查方法：
    （1）取出：盖玻片培养细胞汇合前从瓶中取出：细胞最好处于70%汇合,如细胞完全汇合,能影响支原体的观察.
    （2）漂洗：将细胞盖片置于培养皿中,用不含酚红的Hanks液漂洗；细胞悬液则先离心去上清营养液后,再加入Hanks液漂洗.
    （3）固定：加入固定液5ml,放置10min.
    （4）漂洗：用生理盐水或去离子水漂洗,方法同（2）.
    （5）染色：加入二苯甲酰胺荧光染料工作液5ml,在室温下放置10min.
    （6）漂洗：吸出染液,用5ml水洗3次.
    （7）观察：取出盖玻片空气中干燥,细胞面向上,滴加pH5.5的磷酸缓冲液数滴,覆以盖玻片,在荧光显微镜下观察.

3、结果判定：
    阳性结果：可见细胞周围或细胞膜上有大小不等、不规则荧光着色颗粒（绿色小点）.
    当阴性结果和阳性结果均成立时,实验有效.如怀疑可疑,应重做.

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