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吲哚乙酸氧化酶活性的测定

发布时间 2010-01-15 浏览量 作者: 无 来源: 无

原理:
    吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下,被氧化破坏失去活性.植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小,对调节体内吲哚乙酸的水平,起着重要的作用,而影响植物的生长.酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之.吲哚乙酸的含量可用比色法测定.
仪器药品:
    721型分光光度计;离心机;恒温水浴锅;天平;研钵;试管;移液管;烧杯;
    20mmol/L磷酸缓冲液,pH6.0(见附表2).
    1mmol/L2,4—二氯酚:称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配制成100ml.
    1mmol/L氯化锰:称取MnCl2·4H2O 19.8mg用蒸馏水配制成100ml.
    1mmol/L吲哚乙酸:称取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解,然后将其倒于盛有约90ml蒸馏水的容量瓶中(100ml),稀释至刻度.
    吲哚乙酸试剂A或B(任备其中之一):
    试剂A:15ml 0.5mol/L FeCl3,300ml浓硫酸(比重为1.84),500ml蒸馏水,使用前混合之即成,避光保存.用时1ml样品中加入试剂4ml.
    试剂B:10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%过氯酸,使用前混合之即成,避光保存.用时于样品中加入试剂.试剂B较试剂A灵敏.
操作步骤:
    1、将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3梍4天,选取生长一致的幼苗,除去子叶,留下胚轴作材料.
    2、取20株胚轴,称得重量,置研钵中,加入预冷的磷酸缓冲液5ml,石英砂少许,置冰浴中研磨成匀浆.再按100mg鲜重材料加1ml提取液的比例,用磷酸缓冲液稀释之.离心(4000r/min)20分钟,所得上清液即为粗酶液.
    3、取试管2支,于一试管中加入氯化锰1ml,二氯酚1ml,IAA2ml,酶液1ml,磷酸缓冲液5ml,混合均匀.另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外,其余成分相同.一起置于30℃恒温水浴中,保温30分钟.
    4、吸取反应混合液2ml,加入吲哚乙酸试剂B4ml,摇匀,置于30℃的黑暗处保温30分钟,使显色.
    5、将显色后呈现红色的反应液于分光光度计中测定吸光度,测定时用波长530nm.
    6、根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量(或从直线方程式计算反应液中IAA的残留量).
    7、从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量,即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量.以每ml酶液在1小时内分解破坏吲哚乙酸量(μg)表示酶活力的大小.
    8、配制浓度从0梍25μg/ml的IAA溶液,分别测得吸光度A,然后绘制标准曲线,或计算直线回归方程.

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