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酵母蛋白质的抽提

发布时间 2010-01-15 浏览量 作者: 无 来源: 生物无忧

    此法抽提的酵母蛋白适用于 SDS 凝胶电泳和Western blot分析.
1.从OD600=2的细胞培养物中抽提酵母蛋白质.培养物的一种简单制备方法是将细胞接种到5mlYPD中,过夜培养后获得指数培养物(OD600=0.5~2.0).
2.在水浴上把OD600=2的细胞培养物转到含有2ml的50mmol/LTris-HCl(pH7.5)、10mmol/L叠氮化钠溶液的13mm离心管中,用吊篮式医用离心机离心沉淀细胞.
3.用25号针头吸出上清液,再用30μlESB缓冲液悬浮细胞.
4.快速转入微型离心管,在100℃下保温3分钟,使蛋白酶失活之后,样品存放于-20℃.
5.加入0.1g的0.2mm的玻珠,或装入玻珠直至液体刚好浸没,剧烈振荡混合2分钟.
6.加入70μlESB缓冲液,稍加振荡,置100℃保温1分钟.
    ESB缓冲液(可在4℃贮存数天):
    2%SDS
    80 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)
    10%甘油
    1.5%二硫基苏糖醇(DTT)
    0.1mg/ml溴酚蓝
7.取5~20μl抽提液上样进行SDS凝胶电泳.

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