( 一 ) 原理

    DNA 梯形条带是细胞凋亡的一个周期表现,其原理是细胞受到内外因素作用后,经过信号传代,导致内源性核酸内切酶激活,染色质 DNA 被有规律地切成整数倍的核小体片段,凝胶电泳呈梯形图像.

（二）操作步骤

1 、 DNA 提取

  l用大方瓶培养细胞,每瓶 10ml ,细胞浓度为 3 × 10 ⁸ 个 /ml ,每个药物浓度、作用时间均设 2 瓶,共分 3 个时间段, 4 个药物浓度,共培养 26 瓶细胞.

  l分别于细胞中加入不同浓度的药物或毒物,于 37 ℃、 5% CO ₂ 中分别培养 12h 、 24h 、 48h ,用 PBS 细 2-3 次.

  l于 -20 ℃将细胞冷处理 10min 后将细胞收集至离心管中,加 1ml 细胞裂解液,再加蛋白酶 K 轻轻振摇使悬液混匀,呈黏糊状, 50 ℃过夜.

  l 冷却后加入等体积的饱和酚溶液.混合后 1000r/min 离心 10min ,吸出上层水相,移至另一离心管中,再加入等体积饱和酚溶液重复抽提 1 次,直到无蛋白为止.

  l吸上清加入氯仿 / 异戊醇（ 24 ： 1 ）按上述方法再抽提 1 次.

  l吸取水相层加入 1/10 体积的 3mol/L 的醋酸钠溶液,混匀.

  l再加入 2.5 倍体积冷无水乙醇,混合,置 -20 ℃处理 30min 后, 10000r/min 离心 10min ,沉淀部分为提取的 DNA ,弃去无水乙醇后用 70% 乙醇漂洗 2 次,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干乙醇.

  l 加入 200ulTE 缓冲液融解 DNA ,再加入 25ul 的 RNA 酶,置 37 ℃作用 30min ,置 4 ℃冰箱保存.

2 、琼脂糖凝胶电泳

  l 用 TBE 缓冲液配制 0.8% 琼脂糖凝胶电泳.在微波炉内煮沸至琼脂糖融解, 待冷却至 60 ℃时,加入溴化乙锭使其终浓度为 0.5mg/ml ,混匀后灌胶.

  l待胶凝固后放入含 TBE 电泳液的电泳槽内,使 TBE 电泳液盖过凝胶.

  l 取 10-15ul 提取的各组 DNA 样品液与上样缓冲液按 4 ： 1 比例混匀后点样.

  l80V 电泳 1h ,用紫外透射仪观察梯形条带,并摄影.