提取 DNA 需要的仪器和试剂:
① 1.5ml 离心管
② 移液管:1000ul,200ul,40ul 各一支和移液管尖头:100-1000ul,1-200ul 各一盒
③ 微型滤柱(备用）
④ 小型旋转混合器一台
⑤ 小型离心机:可放入 1.5ml 离心管和 2ml 收集管.
⑥ 恒温水浴
⑦ 电冰箱:-20 ℃,4 ℃
⑧ 无水乙醇(自备)
⑨ 70% 乙醇(自备)
⑩ DNA 提取试剂盒.
内含: ⑴ 裂解液1  ⑵ 裂解液2  ⑶ 消化液 ⑷ 纯化液 ⑸ 弥散液 ⑹ 蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干.

提取 DNA 前注意:
① 使血样品内容物达到室温(15-25℃ ）；
② 预热水浴到 58℃,为步骤 3 做准备；
③ 置弥散液于 58℃ 内,为步骤 4 或步骤 7 做准备；
④ 所有的离心步骤均在室温下进行；
⑤1ml 全血可提得 15-60µgDNA.

一、从 1ml 全血或体液中提取 DNA 的步骤:
⑴ 裂解 1:
    取 1ml 全血,血桨,血清,淋巴细胞放入到 1.5ml 的离心管中,加入 400ul 裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,离心速率为 8000rpm,1min..倒掉上层液,可见离心管底部有血色沉淀.重复此裂解步骤一次,这次是加入 1ml 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上层液弃去,以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液 1.
⑵ 裂解 2:
    在上面离心管中加入 1ml 裂解液 2.上下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,8000rpm,1 min..倒掉上清液,可见离心管底部有微量淡红色沉淀.重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 1ml 裂解液 2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液 2.
⑶ 消化:
     吸取蛋白酶 K 10ul(= 0.2mg)加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 320ul 消化液,上下翻转离心管,务必使沉淀物分散于消化液中.放入 58℃ 水浴中消化 15 分钟.最后可见澄明的消化液体.
⑷ 纯化:
    在上面的消化液体中加入 110ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 15000rpm,1min,把上清液 吸出放入到装有 1000ul 无水乙醇的 1.5ml 离心管中,轻轻上下翻转 10 次,可见絮状 DNA 析出.用带钩的玻璃棒挑起絮状 DNA 放入到 100ul 70% 乙醇中耒回漂洗 20 次,钩出 DNA,在空气中凉干一下后放入到 100ul 弥散液中.把 DNA 弥散液保存于 4℃,过夜,使之充分弥散后 使用.提取完毕.
    如要立即用此 DNA 做 PCR 实验,把 DNA 弥散液放在 58 ℃ 水浴中,保温 30 分钟,用手指拍打离心管子,使 DNA 弥散后使用.提取完毕


⑸ 收集:
   (在 DNA 极少量,不能用带钩玻璃棒挑起的情况下)把有絮状 DNA 的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中,滤器放入离心机内,离心:8000rpm,1 min..DNA 便附着在滤漠上,弃去滤液,把滤柱放回收集管上.
⑹ 吸取 200ul 70% 乙醇于滤柱内,离心 8000rpm,1min,弃去滤液.把滤柱放回收集管上,再心 15000rpm,1 min..使吸附在滤膜上的 DNA 不再附有乙醇.
⑺ 回 收 DNA:把上面附着 DNA 的滤柱放入一个干净的 1.5ml 离心管中.吸取 100ul 已温热到 58 ℃ 的弥散液,轻轻放入滤膜的表面,保温 58 ℃ 静置 10 分钟.离心 8000rpm,1 min.,DNA 弥散液便滤入到干净的 1.5ml 离心管内.此 DNA 弥散液可即时作 PCR 实验用.提取完毕.
    附:如从 2ml 全血中提出取 DNA,方法和步骤与从 1ml 全血一样,只是在步骤 ⑷ 纯化之前,把两个 1ml 全血的消化液管内容物合并后,加入 220ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 15000rpm,1min,把上清液吸出放入到装有 1800ul 无水乙醇的 2ml 管中,轻轻上下翻转10 次,可见絮状 DNA 析出.用带钩的玻璃棒挑起絮状 DNA 放入到 200ul 70% 乙醇中耒回漂洗 20 次,钩出 DNA,在空气中凉干一下后放入到 100ul 弥散液中.把 DNA 弥散液保存于 4 C,过夜,使之充分弥散后使用.提取完毕.
    如要立即用此 DNA 做 PCR 实验,把 DNA 弥散液放在 58 ℃ 水浴中,保温 30 分钟,用手指拍打离心管子,使 DNA 弥散后使用.提取完毕

二．从 200ul 全血或体液中提取基因组DNA的操作步骤
⑴ 裂解 1:
    取 200ul 全血,血桨,血清或淋巴细胞放入到 1.5ml 的离心管中,加入 200ul 的裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放 入离心机中离心,离心速率为 14000rpm,1 min..倒掉上层液,可见离心管底部有微量沉淀.重复此裂解步骤一次,这次也是加 200ul 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 1.
⑵ 裂解 2:
    在上面离心管中加入 200ul 的裂解液 2.上下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,14000rpm,1 min..倒掉上清液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 200ul 裂解液 2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 2.
⑶ 消化:
    吸取蛋白酶 K 5ul(= 0.1mg)加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 85ul 消化液,上下翻转离心管,务必使沉淀物分散于消化液中.放入到 58℃ 水浴中消化 15 分钟.最后可见澄明的消化液体.
⑷ 纯化:
    在上面的消化液体中加入 30ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 14000rpm,1min,把上清液吸出放入到装有 240ul 无水乙醇的 1.5ml 离心管中,轻轻上下翻转 10 次,可见溶液稍有混浊就是絮状 DNA 析出.
⑸ 收集:
    把有絮状 DNA 的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中,滤器放入离心机内离心,离心速率 8000rpm,1 min..DNA 便附着在滤漠上,弃去滤液,把柱滤器放回收集管上.
⑹ 吸取 50ul 70% 乙醇于滤柱内,离心 800rpm,1min,弃去滤液.把滤柱放回收集管上,再离心 15000rpm,1 min..使吸附在滤膜上的 DNA 不再附有乙醇.
⑺ 回 收 DNA:把上面附着 DNA 的滤柱放入一个干净的 1.5ml 离心管中.吸取 50ul 已温热到 58 C 的弥散液,轻轻放入滤膜的表面,滤器在水浴 58℃ 保温 10 分钟.离心 8000rpm,1 min.,DNA 弥散液便滤入到干净的 1.5ml 离心管内.此 DNA 弥散液可即时作 PCR 实验用.提取完毕.


附:从100ul全血或体液中提取基因组DNA
⑴ 裂解 1:
    取 100ul 全血,血桨,血清或淋巴细胞放入到 1.5ml 的离心管中,加入 100ul 的裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放 入离心机中离心,离心速率为 14000rpm,1 min..倒掉上层液,可见离心管底部有微量沉淀.重复此裂解步骤一次,这次也是加 100ul 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 1.
⑵ 裂解 2:
    在上面离心管中加入 100ul 的裂解液 2.上 下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,14000rpm,1 min..倒掉上清液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 100ul 裂解液 2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 2.
⑶ 消化:
    吸取蛋白酶 K 5ul(= 0.1mg)加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 60ul 消化液,上下翻转离心管,务必使沉淀物分散于消化液中.放入到 58℃ 水浴中消化 15 分钟.最后可见澄明的消化液体.
⑷ 纯化:
    在上面的消化液体中加入 20ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 14000rpm,1min,把上清液吸出放入到装有 160ul 无水乙醇的 1.5ml 离心管中,轻轻上下翻转 10 次,可见溶液稍有混浊就是絮状 DNA 析出.
⑸ 收集:
    把有絮状 DNA 的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中,滤器放入离心机内离心,离心速率 8000rpm,1 min..DNA 便附着在滤漠上,弃去滤液,把柱滤器放回收集管上.
⑹ 吸取 50ul 70% 乙醇于滤柱内,离心 800rpm,1min,弃去滤液.把滤柱放回收集管上,再离心 15000rpm,1 min..使吸附在滤膜上的 DNA 不再附有乙醇.
⑺ 回 收 DNA:
    把上面附着 DNA 的滤柱放入一个干净的 1.5ml 离心管中.吸取 50ul 已温热到 58℃ 的弥散液,轻轻放入滤膜的表面,滤器在水浴 58℃ 保温 10 分钟.离心 8000rpm,1 min.,DNA 弥散液便滤入到干净的 1.5ml 离心管内.此 DNA 弥散液可即时作 PCR 实验 用.提取完毕.

三．从10ml 全血中提取基因组DNA的操作步骤
设备要求:离心机能放入 50ml 的离心管.由于离心速率低,因而离心时间长一些.
⑴ 裂解 1:
    取 10ml 抗凝的全血放入到 50ml 的离心管中,加入 10ml 裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,在振摇机中振摇 10 分钟,放入离心机中离 心,离心速率为 2200rpm,10min..可见离心管底部有血色沉淀.倒掉上层液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 10ml 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液 1.
⑵ 裂解 2:
    在上面离心管中加入 10ml 裂解液 2.在振摇机中振摇 10 分钟,务必使沉淀物分散,放入离心机中离心,离心速率为 2200rpm,10 min..可见离心管底部有少量灰色沉 淀.倒掉上层液,留下沉淀..重复此提取步骤一次,这次仍然是加入 10ml 裂解液 2.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的灰白色沉 淀不再残留有裂解液 2.


⑶ 消化:
    吸取蛋白酶 K 100ul(= 2mg)加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 1.6ml 消化液,振摇 3 分钟,放入 58℃ 水浴中消化 1 小时.消化其间,要取出离心管用手拍打一下,帮助内容物均匀消化.最后可见澄明的消化液体.
⑷ 纯化:
    在上面的消化液体中加入 600ul 纯化液,混匀后,离心,速率为 2800rpm,15min,把 上清液吸出放入到装有 5ml 无水乙醇的带盖的管中,轻轻上下翻转 10 次,可见絮状 DNA 析出.用带钩的玻璃棒挑起絮状 DNA 放入到 1000ul 的 70% 乙醇中耒回漂洗 20 次,钩出 DNA,在空气中凉干一下后放入到 500ul 弥散液中.把 DNA 弥散液保存于 4 ℃,过夜,使之充分弥散.提取完 毕.
    如要立即用此 DNA 做 PCR 实验,把 DNA 弥散液放在 58℃ 水浴中,保温 30 分钟,用手指拍打离心管子,使 DNA 弥散后使用.提取完毕.
附:如从 5ml 全血中提取 DNA,只需按比例减少各步骤的试剂用量.

四．从口腔两颊刮物提取DNA的操作步骤
    DNA 的浓度一般是 3-23ug/ml,OD 值为 1.7-1.9.
⑴ 裂 解 1:
     吸取 600ul PBS 到 1.5ml 离心管中,剪入刮颊刷.旋转脉动 15 秒.加入 400ul 裂解液 1.旋转脉动 15 秒后放入离心机中离 心,8000rpm,1 min..倒掉上层液.重复此提取步骤一次,这次是加入 1000ul 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以 使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 1.
⑵ 裂解 2:
    在上面离心管中加入 1000ul 裂解液 2.旋转脉动 15 次后放入离心机中离 心,8000rpm,1 min..可见离心管底部有微量沉淀.倒掉上层清液.重复此裂解步骤一次,这次仍是加入 1000ul 裂解液 2.最后 用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 2.刮刷留在离心管内.
⑶ 消化:
    吸取 20ul 蛋白酶液(= 0.4mg)加入到上面的离心管中,旋转脉动一下,再加入 160ul 消化液,又旋转脉动一下后,放入 58℃ 水浴中消化 15 分钟.取出后 可见澄清的消化液.离心 8000rpm,20 秒,把盖上的液滴回落到管中.然后轻轻取出刮刷去掉.
⑷ 纯化:
    加入 60ul 纯化液到上面离心管中,旋转脉动一下,放入离心机中离心,15000rpm,1min.把上清液吸出放入到 240ul 无水乙醇中 轻轻上下翻转 10 次,可见云状 DNA 析出,并浮于液面..
⑸ 收集:
    把上液倒入微型过滤器中,滤器放入离心机内 离心:8000rpm,1min..DNA 便附着在滤漠上.弃去收集管中的滤液.
⑹ 吸取50ul 70%.乙醇于滤柱内.离心 8000rpm,1 min.弃去收集管中的滤液.再次离心,离心速率为 15000rpm,1 min.,使吸附在滤膜上的 DNA 不再附有乙醇.
⑺ 回收DNA:
    把上面附着 DNA 的滤柱放在一个干净的 1.5ml 离心管中.吸取 100ul 弥散液轻轻放入滤膜的表面(弥散液事先要温热到 58℃,弥散 效果更好),静置 10 分钟.离心 8000rpm,1 min.含 DNA 的弥散液便滤入到干净的 1.5ml 离心管中.提取完毕.

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