饲料中添加四环素类药物和临床上大量滥用四环素类药物,被认为是引起病原菌的耐药性大量产生的原因［1］.四环素类药物早在20世纪60～70年代就已广泛应用,尤其在兽医的临床上更是如此,所以导致细菌对四环素类的耐药性颇为严重,我国的情况更是如此.抗生素的选择性压力、外源性耐药质粒的获得、耐药质粒及转座子在肠道菌间的传递等是耐药菌株产生和不断增多的主要原因,四环素耐药性的产生常常是由于获得了有关接合质粒或转座子中新的四环素耐药基因tet.另外, 沙门氏菌还可以感染人和其他动物,耐药性的研究,是关系到兽医、食品卫生和人类健康的严肃的问题,绝不能掉以轻心.本文就禽源沙门氏菌的耐药质粒的四环素耐药基因tetC 进行了分子生物学水平诊断方面的研究.

1  材料与方法
    1.1  材料
    1.1.1  菌株  沙门氏菌标准株：C79-13(购自中国兽药监察所),药敏质控菌ATCC25922(购自生物制品监察所),临床上经分离培养并经细菌学和生化及血清学鉴定的禽源沙门氏菌11株(西南民族大学生命科学与技术学院禽病研究所分离).
    1.1.2  培养基及常规化学药品和试剂  四环素、金霉素、土霉素、强力霉素药敏纸片(购自北京天坛药物生物技术开发公司)；四硫磺酸钠煌绿增菌培养基、亚硒酸盐胱氨酸增菌培养基、SS培养基、三糖铁琼脂培养基、LB培养基(由国产试剂自配)；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有限公司)、沙门氏菌属诊断血清试剂盒(购自成都生物制品研究所).
    1.1.3  分子生物学试剂和用品  100bp DNA Marker、PBR322、PUC18、Taq PCR试剂盒(购自天为时代科技有限公司)；Biospin胶回收试剂盒(购自Bioer Technology有限公司)；带正电尼龙膜、硝酸纤维膜、杂交袋或杂交瓶、紫外交联仪(购自华美公司)；暴光盒(购自粤华公司)；胶片(购自柯达公司)；鲑鱼精DNA、电泳级琼脂糖(购自宝生物工程有限公司)；质粒小提量试剂盒(购自OMEGA生物科技公司)；TAE自配；HybQUEST?Complete System(购自美国Mirus生物公司)；X-ray光机(上海讯星电子科技公司).
    1.2  方法
    1.2.1  
      病原菌的临床分离和鉴定  对于临床上的疑似沙门氏菌病例,经无菌接种和四硫磺酸钠煌绿培养基增菌培养以及SS培养和三糖铁培养,再经生化和血清学鉴定以确定沙门氏菌.具体方法见试剂盒说明书和参考文献［1］.
    1.2.2  药敏试验  以大肠杆菌ATCC25922做药敏质控菌,采用琼脂平板稀释分别测定禽原沙门氏菌对四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的MIC值.具体参考文献参见［1］.
    1.2.3  tetC基因的PCR  引物设计：根据Genebank中注册的tetC的序列,用DNA Man软件处理后,提交序列给大连宝生物公司,再用OLIGO6.0软件设计四环素抗性基因TetC的引物.
    LEFT PRIMER22  59.86  45.45  4.00  1.00 agattgtcacgaccacatcatc
    RIGHT PRIMER  22  60.16  45.45  3.00  0.00 actttctaaggcagaccaacca
    模板制备:用小提量的质粒提取试剂盒(美国进口试剂盒,由天泰公司提供),步骤按说明书上的方法进行,但需要优化步骤.模板稀释10倍.
    对照：以PBR322为阳性对照,以PUC18作为阴性对照.50μl反应体系：(1)模板DNA 1μl;(2)LEFT PRIMER 1μl、RIGHT PRIMER 1μl(贮存液稀释10倍);(3)10×Taq buffer 5μl;(4)dNTP mixture 4μl;(5)MgCl2 4μl;(6)Taq 1μl;(7)ddH2O 34μl.
    反应条件：Step1 94℃ 3min： Step2 94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 1min,35个循环：Step3 72℃ 5min.
    1.2.4  tetC基因的序列分析  试剂回收后,送大连宝生物公司测序,再与Genebank中注册的PBR322中的TetC基因序列在DNA Man软件进行比对,分析其同源性.
    1.2.5  DNP标记核酸探针  经纯化和回收的PCR产物经DNP标记,制备成核酸探针.
    标记反应体系(20μl)：(1)Diluted Sample DNA(14μl);(2)10×Labeling Buffer A(2μl);(3)Label IT?Reagent(4μl).
    对照标记反应体系(20μl)：(1)Control DNA(8μl);(2)无核酶水(6μl);(3)10×Labeling Buffer A(2μl);(4)Label IT?Reagent(4μl).
    制法：稀释2μl的Sample DNA至14μl,加它到盛有Label IT?Reagent的小瓶内,再加入2μl的10×Labeling Buffer A,轻轻摇匀,37℃孵化1h后,利用乙醇沉淀法或使用G50微螺旋纯化柱,从已标记的DNA中除去未反应的Label IT?Reagent,然后储存在-20℃冰箱中备用.具体操作见文献［2,3］以及标记试剂盒说明并经优化处理.


    1.2.6  细菌菌落转移  在琼脂平皿上(含有四环素的营养培养基)接种细菌,经培养后获得所需要的大量的细菌克隆.准备一些带正电的尼龙膜,灭菌之后,把膜放在琼脂平面上转移细菌克隆到新的含有四环素的琼脂平面上培养,孵育几个小时(37℃),然后经细胞裂解、DNA变性和固定后,为杂交做好准备,具体操作见文献［2,3］以及标记试剂盒说明并经优化处理.
    1.2.7  预杂交和杂交  预杂交：加一定量的鲑鱼精液DNA和杂交液到杂交袋或杂交瓶中,涡旋旋浮,37℃～42℃孵化几个小时,具体操作见试剂盒说明并经优化处理.杂交：从袋中移去预杂交液,然后在膜上加入杂交液(已加入一定量的准备好的探针),排除空气密封袋子,在37℃～42℃孵化几个小时,反应在自动调温和定时的杂交仪中进行,具体操作见试剂盒说明并经优化处理和文献［3］.
    1.2.8  检测  经洗涤和Wash Buffer漂洗之后,在室温下加已准备好的膜封闭液,再在已稀释的抗体溶液中培育膜30min左右,经几次Wash Buffer洗涤和Dtectioon Buffer平衡后,取出后加化学底物酶作用物到膜上,经处理后把膜放在膜片盒上,再在X-ray光机下暴光一段时间,最后显影胶片,具体操作见试剂盒说明并经优化处理和文献［3］.

2  结果
    2.2.1  病原菌的临床分离和鉴定  对于临床上的疑似沙门氏菌病例,经无菌接种和增菌培养以及SS培养和三糖铁培养,再经生化和血清学鉴定后,确定有11株属于沙门氏菌属.
    2.2.2  药敏试验  临床分离并经生化实验和血清学鉴定的11株禽源沙门氏菌和1株标准株(C79-13),经药敏试验证明：有11株有高耐药性,另外1株(C79-13)有低耐药性,经药敏试验证明均呈高耐药性,耐药率达100%.
    2.2.3  tetC基因的PCR  对5株致病性沙门氏菌和1株标准菌株的TetC基因均能扩增出约400bp的特异性产物,而阳性对照PBR322也扩增出同样大小的片段,阴性对照PUC18则无,在2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1. 图1  沙门氏菌四环素耐药基因tetC 的PCR 扩增图(略)
    2.2.4  tetC 的核苷酸序列分析  据测序报告,PCR 产物序列中包含了全基因tetC的一部分,将菌株C79-13 和PBR322 的核苷酸比较,其同源率为97.4%；分离的都柏林沙门氏菌与菌株C79-13的同源率为98.2%；而PBR322和都柏林沙门氏菌的同源率为98.6%.
    2.2.5  标记和杂交结果  经DNP标记制备成核酸探针后,再经菌落转移和预杂交和杂交,最后加化学底物酶作用物到膜上,经处理后把膜放在膜片盒上,再在X-ray光机下暴光一段时间,最后显影胶片,其结果表明：阳性菌株11株(包括阳性对照PBR322),阴性菌株1株,阴性对照PUC18呈阴性,重复几次,结果一样.

3  讨论
    (1)四环素的耐药性非常普遍,据很多资料报道和本研究药敏试验表明：耐药性可达到100%.对其耐药菌株的基因tetC进行PCR后发现,均能扩增出400bp左右基因片段,这与代敏等［4,5］报道的基本一致.与药敏试验的符合率为100%.说明在养禽场使用四环素相当普遍,特别是饲料中亚治疗剂量的添加,是引起四环素耐药性增加的主要原因［6,7］.另外,本试验研究表明：质粒上的基因tetC是介导禽源沙门氏的主要遗传物质,抗生素的选择性压力、外源性耐药质粒的获得、耐药质粒及转座子在肠道菌间的传递等是耐药菌株产生和不断增多的主要原因,四环素耐药性的产生常常是由于获得了有关接合质粒或转座子中新的四环素耐药基因tet的缘故.这与Mendez等［8］报道的一致,是否有其他遗传物质介导,以及是否有其他耐要机制,还需要进一步研究.
    (2)用DNP标记其PCR产物,应用于核酸探针技术,在国内资料中还未见过报道,它比放射性标记安全性好,与光生物素标记敏感性强,而且比其他酶和非酶的标记更加稳定,比酶标记反应更加容易控制,特别适合于像菌落原位杂交和斑点杂交这样要求敏感性很高的杂交反应,本实验表明：对12株沙门氏菌进行杂交检测,检出11株,具有检出率高的优点,并且标记容易、标记率高、重复性好、准确率高的优点,从分子水平上定位抗药性基因,可用于分子流行病学的监测以及为构建DNA探针奠定基础.
    (3)取1株高耐药性菌株(都柏林沙门氏菌)和1株低耐药性菌株(C79-13)PCR后,经测序表明：菌株C79-13 和PBR322 的核苷酸比较,其同源率为97.4%；分离的都柏林沙门氏菌与菌株C79-13的同源率为98.2%；而PBR322和都柏林沙门氏菌的同源率为98.6%,说明不同来源和不同耐药性的菌株,其同源性很高,这与Ng等［9,10］报道的一致.
    【参考文献】
    1  廖延雄．兽医微生物实验诊断手册．北京：中国农业出版社,1995,5-131.
    2  萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T著． 金冬雁． 黎孟枫译． 分子克隆实验指南, 第2版.北京：科学出版社,1995,311.
    3  FM,奥斯伯,RE．金斯顿,JG 塞徳曼,等著．马学军,舒跃龙译．精编分子生物学实验指南,第4版.北京：科学出版社,2005,199-207.
    4  代敏, 王红宁,吴琦,等．猪源致病性沙门氏菌四环素耐药基因tetC 的PCR 扩增及序列分析．中国抗生素杂志,2004,24(9)：415-417.
    5  代敏, 王红宁． PCR和核酸探针检测猪源沙门氏菌四环素耐药性基因tetC的研究．畜牧兽医学报,2005,36(5)：482-485．
    6  李新圃, 张礼华, 郁杰, 等． 抗生素耐药性问题研究概况． 天津畜牧兽医, 1996,13(4)：18.
    7  吴承龙． 细菌R 质粒在菌群中的转移及细菌耐药性扩散． 中国人兽共患病杂志, 1998,14(6)： 49.
    8  Mendez B, Jachibana C, Levy S B． Heterogeneity of tetracycline resistance determinants． Plasmids,1997 ,3：99.
    9  Ng LK, Martin I,Alfa QM,et al．Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistance genes ． MolCell Probes, 2001, 15 (4)：209.
    10  Ng LK, Mulvey MR, Martin I, et al． Genetic characterization of antimcrobial resistance in Canadian isolates of Salmonella Serovar Typhimurium DT104． Antimicrob Agents Chem Other,1999,43 (12)： 3018.

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