登革热是流行于热带、亚热带地区的一种急性虫媒传染病,其病原体为登革病毒,近年来随着全球气候变暖和国际旅游的增多,登革病毒感染呈扩大蔓延之势,发病率不断升高.由于缺乏疫苗和有效的防治措施,因此对该疾病实行早期诊断十分必要.
    登革病毒属于黄病毒科黄病毒属, 为单股正链ＲＮＡ病毒,基因组长约11ｋｂ.依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型(ＤＥＮ1～4)［1,2］.登革病毒感染的实验室诊断,传统方法是从患者血清中分离病毒,或用血清学方法检测病毒的特异性抗体.但病毒分离费时,检测血清抗体需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清, 同时存在广泛的交叉反应而受到干扰［3］,这些均不利于疾病的早期诊断.近年来国内外均有报道应用RT-PCR检测登革热病毒［4］,但RT-PCR方法容易造成污染,同时也存在从临床血清标本中检测登革病毒敏感性不够的问题.这就需要建立一种更敏感、特异和快速的检测鉴定方法,以实现对登革热患者的早期快速诊断,为预防控制登革热的流行赢得时间.本研究比较了利用TaqmanMGB探针技术的实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒特异性,以期选择特异性好、灵敏度高的检测方法,达到快速诊断登革热的目的.
    1  材料与方法
    1.1  毒株及血清标本  登革病毒1～4型标准株由广东省疾病预防控制中心提供,乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株由成都生物制品所提供.血清标本采自深圳市近几年发病2周内的疑似登革热病人和发病10天内的疑似乙脑病人,-80℃保存.
    1.2  主要试剂  病毒RNA提取试剂盒为Roche公司产品,TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、随机引物购自Invitrogen公司,dNTP购自上海生工公司, AMV逆转录酶、RNaseinhibitor购自大连宝生物公司,引物和荧光探针由上海基康生物技术有限公司合成及标记,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化.
    1.3  主要仪器设备  Centrifuge 5415D台式高速离心机购自德国Eppendorf公司, Ultrospec 2000紫外可见光蛋白核酸分析仪购自美国GE公司, 9700基因扩增仪购自美国ABI公司,Gene Genius凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司, Mx4000荧光PCR仪购自美国Stratagene公司.
    1.4  引物及探针设计  在GeneBank上检索登革病毒4个血清型中都一致的高度保守序列,根据登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列,设计登革1～4型RT-PCR通用引物,扩增片段长度为511bp.根据DEN 3端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1～4型荧光PCR通用引物和Taqman探针,探针5′用FAM报告荧光基团标记,3′用MGB淬灭荧光基团标记,扩增片段长度为68bp.
    登革病毒RT-PCR通用引物：
    Den-D1： 5′ TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG　3′
    Den-D2： 5′ TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC　3′
    登革病毒荧光PCR通用引物：
    Den-FP： 5′ GCATATTGACGCTGGGAGAGA　3′
    Den-RP： 5′GGCGTTCTGTGCCTGGAAT　3′
    登革病毒通用探针：
    Den-Probe：5′ FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB　3′
    引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记.
    1.5  病毒RNA提取  1～4型登革病毒标准株用1640培养液溶解,接种C6/36细胞,传代次,按病毒RNA提取试剂盒说明书操作,提取病毒RNA,RNA置-80℃保存备用.


    1.6  反转录及普通PCR
    1.6.1  RNA逆转录  反应总体积为20μl,在反应管内依次加入：5×缓冲液5μl,2.5mmol/L 4×dNTP 1μl,0.3μg/μl Random（Invitrogen公司生产）引物1μl,提取的RNA 12μl,AMV逆转录酶（10u/μl）1μl混匀.反应条件为：42℃ 60min→95℃加热5min→4℃保存.然后将产物放置于-20℃备用.
    1.6.2  PCR扩增  反应总体积为20μl,在反应管内依次加入：10×缓冲液2μl,2.5mmol/L,4×dNTP 1μl,25mmol/LMgCl2 2.5μl,通用引物D1、D2（5μmol/L）各1μl,RT产物0.5μl（Ⅰ型,Ⅱ型,Ⅳ型）、2μl（Ⅲ型,血清标本,阴性对照）,Taq酶（5u/μl） 0.25μl,加H2O补足体系.反应条件为：94℃ 5min→94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,循环40次→72℃延伸10min→4℃保存.
    1.6.3  扩增产物电泳分析  配制含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶,取10μlPCR产物电泳,在凝胶成像仪上观察并照相记录实验结果.
    1.7  实时荧光PCR  反应总体积为25μl,在反应管内依次加入：10×缓冲液2μl,10mmol/L 4×dNTP 0.75μl,50mmol MgCl2/L 2.5μl,引物Den-FP,Den-RP（10μmol/L）各0.5μl,探针Den-probe（5μmol/L）0.6μl,RT产物0.5μl（Ⅰ型,Ⅱ型,Ⅳ型）、2μl（Ⅲ型,血清标本,阴性对照）,Taq酶（5u/μl）0.25μl,加H2O补足25μl体系.反应条件是：50℃ 2min→95℃ 10min→95℃ 30s→60℃ 30s,循环40次→4℃保存.采用MX4000实时荧光PCR扩增仪进行扩增,延伸阶段检测荧光.
    2  结果
    2.1  普通RT-PCR检测结果  1～4型登革病毒标准株、10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清,其IgM、 IgG检测为阳性,乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株进行RT-PCR检测,在511bp处1～4型登革病毒标准株都出现了目的基因条带,10份疑似登革病毒感染病人血清只有2份出现目的基因条带,其他标本都为阴性,见图1.说明此RT-PCR检测体系具有良好的特异性.
    注： DNA分子质量标准；1～4分别为Ⅰ～Ⅳ型登革毒株；
    5～13血清标本（其中5和8为同一标本）；>   
    14、15为乙脑病毒对照；-为空白对照 
     图1  登革Ⅰ～Ⅳ型毒株和血清标本PCR扩增结果
    2.2  登革病毒Taqman MGB PCR体系检测结果
    2.2.1  有效性检验  按1.7方法,分别提取登革病毒1～4标准株RNA,进行反转录的实时PCR,1～4型均观察到荧光信号增强.
    2.2.2  特异性分析  登革病毒1～4标准株、乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株经TaqmanMGB体系检测,只有登革病毒1～4标准株观察到荧光信号增加外,乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株均没有荧光增加信号,见图2.这证明了此TaqmanMGB检测体系的特异性.
    2.2.3  登革病毒TaqmanMGB PCR检测体系的应用  用Ⅱ型登革病毒作为阳性对照,对10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清,其IgM、 IgG检测为阳性,8份发病10天内疑似乙脑病毒感染病人血清作为对照,其IgM、 IgG检测为阳性.进行TaqmanMGB PCR检测,结果只有5份疑似登革病毒感染病人血清出现荧光信号增加,其他血清标本均无荧光信号.见图3.注：1、2、3、4分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ登革病毒标准株
    图2  登革病毒荧光PCR特异性分析
    注：1：Ⅱ型登革病毒标准株；
    2～6：疑似登革病毒感染病人血清标本
    图3  血清标本荧光PCR检测结果
    3  讨论
    Taqman探针是一条与病原体核酸特异性结合的荧光素标记探针,它的结合位点位于普通PCR的2条引物之间［5］.探针的5′端和3′端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团,PCR扩增在加入一对引物的同时加入荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收.PCR扩增时, Taq酶发挥它的5′→3′的外切酶功能,将探针切成单核苷酸,5′端发出的荧光信号不再被3′端所吸收而能被仪器检测到.每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.因此,随着PCR产物的不断增加,仪器所检测到的荧光信号越来越强.当标本中不含病原体时,PCR反应不发生,不产生荧光信号,其扩增曲线为一水平线.


    TaqmanMGB探针是在Taqman原理基础上提出的［6］.TaqmanMGB探针的突出优点是实验优化、步骤简单,提高了配对与非配对模板间的Tm值差异,由于在探针的3′端的淬灭基团为不发光的荧光基团,并且与报告基团在空间位置更接近,使杂交的稳定性和重复性大大提高,实验的结果更精确,分辨率更高.
    笔者在TaqmanMGB技术基础上,建立了实时PCR检测1～4型登革病毒的方法.上述研究结果表明：（1）本检测方法可靠性好、敏感性高,比普通PCR方法灵敏度提高30%,可检测发病10天内的临床血清标本,而传统的登革病毒分离方法要求发病5天内的标本,才有可能分离出阳性.（2）特异性强,收集荧光在较高的退火温度(60℃)进行,排除了模板的非特异性扩增,同时,与容易造成血清学交叉反应的乙脑病毒及其临床标本都无交叉反应,可用于登革病毒特异性的实时PCR检测.（3）操作简单,结果观察直观明了,采用闭管检测和荧光技术,避免了普通PCR方法容易产生交叉污染而发生非特异性扩增的缺陷,并可防止病毒扩散及环境污染,以及强致癌物溴乙锭对操作人员的危害.（4）快速.传统的登革病毒分离方法耗时较长,至少需半个月,而本方法所需时间仅4h,比传统方法大为缩短,适用于登革病毒的快速准确的检测.
【参考文献】
    1  肖维威,马文丽,郑文岭.登革病毒的基因组结构及其基因检测.中华检验医学杂志,2003,26(3)：188-189.   
    2  Jelinek T. Dengue fever in international travelers. Clin Infec Dis,2000,31：144-147.   
    3  Schwartz E, Mileguir F, Grossman Z,et al. Evaluation of ELISA-based sero-diagnosis of dengue fever in travelers. J Clin Virol,2000,19(3)：169-173.   
    4  Drosten C, Gottig S, Schilling S, et al. Rapid detection and quantification of RNA of ebola and marburg viruses, lassa virus, crimean-congo hemorrhagic fever virus, rift valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol,2002,40(7)： 2323-2330.   
    5  Callahan JD, Wu SJ, Dion-Schultz A, et al. Development and evaluation of serotype-and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. J Clin Microbiol,2001,39(11)： 4119-4124.   
    6  Zhao JR, Bai YJ, Zhang QH, et al. Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology. World J Gastroenterol,2005, 11(4)：508-510.