p16基因是一个重要的肿瘤抑制基因[1],参与细胞周期的调控,控制细胞生长和分化.死亡相关蛋白激酶（death?associated protein kinase,dapk）基因是一种钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是凋亡的正性调节因子之一[2,3], 现已发现在多种肿瘤组织存在p16和dapk基因启动子的甲基化,提示这些基因的甲基化可能与肿瘤的发生发展有关.本文运用甲基化特异性pcr(msp)技术检测原发性肝癌（plc）患者血清循环核酸中dapk基因、p16基因甲基化的状况,并探讨检测血清dapk基因、p16基因甲基化的临床意义.
　　1  资料与方法
　　1.1  研究对象  64例plc患者均为住院病例,其中男性44例,女性20例,年龄38～82岁,中位年龄64岁.所有病例均有组织病理学和/或细胞学诊断依据.按1997年uicc标准分期,ⅰ期5例,ⅱ期23例,ⅲ期21例,ⅳ期15例(其中25例接受手术治疗).hbsag阳性的36例,阴性为28例；afp>400ug/l的30例,31μg/l    
　　所有病例均于入院后次日留取血清标本,其中手术病例在术后2周留取第二次血清标本,所有标本保存于?30℃冰箱待检.
　　1.2  试剂与仪器  dna提取及清洁使用杭州维特洁生化公司提供的试剂盒；taq酶购自promega公司；dna分子量marker购自华美生物工程公司；电泳琼脂糖为sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯.主要仪器包括ptc?100型pcr仪,ecps3000/150电泳仪,txt?20m凝胶成像系统(uvp)等.
　　1.3  dna制备  试剂盒提取dna,紫外分光光度计测定dna含量,吸光度a260/a280>/1.8.
　　亚硫酸处理按照herman’s的经典方法[4],处理后dna标本用清洁试剂盒纯化,所得dna用3mol/l氢氧化钠碱化,冷乙醇沉淀,适量双蒸水溶解修饰处理的dna,立即扩增或?20℃保存.
　　1.4  pcr反应体系  见表1.
　　表1  pcr引物[5]：引物顺序及pcr产物大小（略）
　　*m=methylated?specific primers；u=unmethylated?specific primer
　　pcr扩增：反应总体积50μl ,反应体系为：甲基化处理过的dna模板5μl, 6mmol/l mgcl2, 1.6μmol/l pcr primers, 2.5units hotstar taq dna polymerase (promega), 0.1mmol/l dntp5.循环参数：96℃变性5min,后加入taq酶,接着96℃ 45s,62℃ 50s,72℃ 90s,循环35个循环,最后72 ℃ 延长10min.
    水代替dna作为空白对照,健康献血者dna作为未甲基化分析的阳性对照,外周血中的淋巴细胞的dna经sssi甲基化酶处理后作为甲基化分析的阳性对照.扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳,紫外光照显带.
　　1.5  统计学处理  用spss10.0软件进行分析,不同组别dapk基因甲基化检出率的比较采用r×c表χ2检验.
　　2  结果
　　2.1  不同组别两基因甲基化检出率的比较  64例plc患者血清经msp法检测后,49例在p16基因5’端启动子区域的cpg岛存在甲基化,见图1.检出率为76.6％；26例在dapk基因5’端启动子区域的cpg岛存在甲基化,见图2.检出率为40.6％；而20例正常人和15例良性肝部疾病患者血清均未检出两基因甲基化,plc患者与正常人和良性肝部疾病患者血清两基因甲基化检出率比较有显著性差异（pp16=0.000,pdapk=0.000）.
　　2.2  两基因甲基化检出率与hbsag的关系  hbsag阳性组血清p16基因和dapk基因甲基化检出率分别为75.0％（27/36）和41.7％（15/36）,hbsag阴性组血清p16基因和dapk基因甲基化检出率分别为78.6％（22/28）和39.3％（11/28）,两组检出率均无统计学差异（pp16=0.738,pdapk=0.847）.


　　2.3  两基因甲基化检出率与临床病期的关系  为便于统计学处理把ⅰ、ⅱ期合并分析,p16基因ⅰ＋ⅱ期甲基化检出率为75.0％（21/28）,ⅲ期为76.2％（16/21）,ⅳ期为80.0％（12/15）, dapk则为42.9％（12/28）,38.1％（8/21）,40.0％（6/15）,经统计学处理,不同的病期间两基因甲基化检出率无显著性差异（pp16=0.933,pdapk=0.944）.
　　图1  plc患者及对照组血清p16甲基化的检测结果（略）
　　u：p16?u特异性引物进行扩增； m: p16?m特异性引物进行扩增；1：健康献血者血标本；2：肝癌患者血标本；3：p16?m阳性对照；4：水的空白对照
　　图2  plc患者及对照组血清dapk甲基化的检测结果（略）
　　u：dapk?u特异性引物进行扩增； m: dapk?m特异性引物进行扩增；1：健康献血者血标本；2：肝癌患者血标本；3：dapk?m阳性对照；4：水的空白对照
　　2.4  两基因甲基化检出率与plc远处转移的关系  远处转移组血清p16基因和dapk基因甲基化检出率分别为80.0％（12/15）和40.0％（6/15）,未转移组为75.5％（37/49）和40.8％（20/49）,无统计学意义（pp16=0.719,pdapk=0.955）.
　　2.5  手术前后两基因甲基化检出率的比较  手术患者术前血清p16基因和dapk基因甲基化检出率分别为72.0％（18/25）和36.0％（9/25）,术后2周则为68.0％（17/25）和28.0％（7/25）,术前、术后甲基化检出率无显著差异（pp16=0.758,pdapk=0.544）.
       2.6  两基因甲基化检出率与afp的关系  p16基因甲基化检出率afp>400ug/l的为90.0％（27/30）、31ug/l400ug/l的plc患者两基因甲基化检出率与afp<400ug/l的有统计学差异（pp16=0.033,pdapk=0.002）.
      2.7  两基因甲基化检出率的比较  两种指标均阳性的15例,而p16基因甲基化阳性、dapk基因甲基化阴性的34例,dapk基因甲基化阳性而p16基因甲基化阴性的11例,64例plc患者至少一种指标阳性的为60例,达93.8%.
　　3  讨论
    研究表明,60％的人类基因5’端启动子区存在cpg岛,这些cpg岛的甲基化可引起染色质结构、dna构型、dna稳定性及dna与蛋白因子相互作用方式的改变从而控制基因表达.当dna处于高甲基化状态时,基因表达受抑制,相反则基因表达可顺利进行.因此,dna异常甲基化的检测已成为探讨肿瘤发生机制的新的研究热点.
    dapk基因其产物是钙调素依赖激酶,参与细胞凋亡过程,研究表明其cpg岛异常甲基化可导致基因低表达或缺失可能是参与细胞癌变的重要机制之一.
    p16基因其产物是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制因子, 其失活是肝癌中常见的遗传学改变.它失活机理除基因缺失和突变外,5’端启动子区域cpg岛的甲基化使其不能转录,是该基因表达异常或失活的另一途径.


    alonso等[5]研究证实只有肿瘤组织标本基因高度甲基化阳性,其血液标本才可能阳性.由此可证明循环核酸的来源极可能是肿瘤细胞,而检测循环核酸为非侵入性肿瘤诊断试验提供了可能性. 
    afp是数十年来一直沿用的常规血清学检测指标,目前统计数据显示afp诊断原发性肝癌的阳性率为60％～70%,灵敏度70％左右[6],有研究表明当血清afp含量大于45 ng/ml其标本p16甲基化检测也均异常,而血清afp含量小于或等于45 ng/ml其标本p16甲基化检测57％异常[1],可以看出dna甲基化检测比传统血清蛋白肿瘤指标检测更灵敏,更有利于肿瘤早期发现及诊断.本实验中afp>400ug/l的plc患者两基因甲基化检出率与afp<400ug/l的有统计学差异, afp<400ug/l的（包括afp正常的）两基因甲基化检出率低于afp>400ug/l的两基因甲基化检出率.64例plc患者有93.8%至少一种基因指标阳性,提示p16基因和dapk基因与afp联合检测,可明显提高plc患者的早期发现率.
    本研究发现,plc患者血清dapk基因、p16基因甲基化检出率分别为40.6％（26/64）、76.6％（49/64）,而正常对照组和良性肝部疾病患者组血清未检出dapk基因、p16基因甲基化,提示检测plc患者的循环核酸中dapk基因、p16基因甲基化可作为plc早期诊断的分子生物学标志物,且其方法基本无创,病人易于接受,从而临床有推广可能,当然也可用于高危人群的筛选确立.
【参考文献】
  　［1］ chen xq, stroun m, magnenat jl, et al. microsatellite alterations in plasma dna of small cell cancer patients［j］. nat med, 1996, 2(9):1033-1035.
　　［2］ p. gonzalez-gomez, m.j. bello, j. lomas, et al. aberrant methylation of multiple genes in neuroblastic tumours : relationship with mycn amplification and allelic status at 1p［j］. european journal of cancer,2003 ,39(10): 1478?1485.
　　［3］ 林勍,陈龙邦. 最新的肿瘤预警指标：死亡相关蛋白激酶［j］. 中国临床康复,2004,8（23）: 4815-4817.
　　［4］ herman jg, graff jr, myohanen s, et al. methylation-specific pcr: a novel pcr assay for methylation status of cpg islands［j］. proc. natl. acad. sci. usa,1996,93 (18): 9821–9826.
　　［5］ alonso me, bello mj, gonzalez-gomez p, et al. aberrant promoter methylation of multiple genes in oligodendrogliomas and ependymomas［j］. cancer genet cytogenet,2003,144(2): 134?142.
　　［6］ 成胜权,王文亮,晏伟, 等. 凋亡抑制基因survivin在人肝细胞肝癌中的表达及其临床意义［j］. 医学研究生学报,2004,17（4）: 296-299.