胃癌是世界范围内发病率较高的肿瘤之一,我国属于胃癌高发地区［1］.已有研究表明［2,3］,胃癌的发生、发展是多因素、多基因变异累积的复杂病变过程.到目前为止,对胃癌最终形成的分子病理学改变仍不是十分清楚.分离鉴定与胃癌发生、发展有关的分子与基因,寻找胃癌组织与正常胃黏膜的差异,分子标志物对阐明胃癌的发生、发展机制,及对胃癌的预防、诊断与综合治疗都有重要意义.Klade CS等人［4］研究发现SM22蛋白在胃癌中表达上调,有关SM22基因与胃癌发生、发展之间的关系国内外尚未见相关报道.本研究利用RT-PCR技术检测SM22基因在胃癌及正常对照组织中的表达差异.
    1  资料与方法
    1.1  标本来源  胃癌及正常组织标本均取自2002年9月~2003年7月内蒙古医学院附属医院、内蒙古医院和北京大学附属肿瘤医院胃癌手术切除患者.男35例,女7例；平均（53.67±17.59）岁.标本在手术切除后1h内获得,所有标本均经过临床病理验证,腺癌38例,鳞癌4例.其中配对胃癌组织14例,胃正常组织取自距相应胃癌病灶5cm以上胃黏膜,未配对胃癌组织标本28例.标本在获得后立即放入液氮或-80℃低温冰柜中保存.
    1.2  引物的设计与合成  根据SM22基因cDNA核酸序列设计引物,SM22,上游引物：5 ′―TGG TGA ACA GCC TGT ACC CT―3′,下游引物5′―CAC GGT AGT GCC CAT CAT TC―3′,扩增产物片段长度为235bp.以GAPDH为内对照,上游引物：5′―ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC―3′,下游引物：5′―TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA―3′,扩增产物片段长度为472bp.所有引物均由北京奥科生物技术公司合成.
    1.3  酸性酚―异硫氰酸胍法制备总RNA  0.5g匀浆研碎的组织加2.5ml裂解液,将裂解液倒入10ml离心管中,冰浴10min.加入0.2M醋酸钠/0.1mM ATA  0.25ml,强烈振混,30s×2次.加ATA饱和的酚2.75ml,强烈振混,30s×2次.加24∶1氯仿：异戊醇0.55ml,强烈振混,30s×2次.冰浴15min后,于4℃,10000rpm离心20min.取上清,加1.1ml异丙醇-20℃冰箱沉淀1h.4℃,10000rpm离心20min.弃上清,将沉淀溶于RNA变性液150μl中.加15μl 3M醋酸钠,330μl无水乙醇-20℃冰箱沉淀1h后保存备用.产物用紫外分光光度计测量RNA纯度A260/A280在1.8~2.2之间.
    1.4  RT-PCR及PCR  mRNA逆转录成cDNA（第一链的合成）5μg总RNA 4℃ 12000rpm离心25min,弃上清,洗盐后加入0.2μl/管,用DEPC・H2O稀释成20μl后,70℃变性10min,迅速插冰冷却.加入5×RT缓冲液6μl,dNTP 2μl,Rnasin 0.5μl,混匀,加入M-MLVE 1μl,37℃孵育1h,70℃15min终止反应,-20℃保存备用.PCR反应体系采用20μl PCR反应体系,PCR循环参数：95℃充分变性2min30s；94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,33个循环；循环反应结束后,72℃充分延伸10min；4℃保存.以GAPDH为内对照,每次PCR反应均设阴性、阳性对照.
    1.5  PCR产物鉴定及半定量分析  PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶（含0.25μg/ml EB）电泳（80V,20min）,紫外仪下观察PCR产物的含量和特异性.运用AlphalmagerTM2200凝胶成像系统控制的AlphaEaseTM独立软件包照相,并行密度扫描半定量,比较目的片段和内对照产物含量,以SM22与内对照GAPDH密度扫描值的读数之比作为评价SM22基因mRNA表达水平的指标,分析胃癌组织及其相应正常组织的表达差异.
    1.6  统计学方法  使用SPSS 10.0软件进行相关统计学分析,以P＜0.05为统计学显著水平.


    2  结果
    RT-PCR结果显示在42例肿瘤组织中有39例存在SM22 mRNA表达,阳性表达率为92.86%,14例正常对照标本中10例SM22 mRNA表达阳性,阳性表达率为71.43%,胃癌组织中SM22基因表达阳性率与正常对照组相比差异无显著性（见表1）.经过半定量光密度计数后SM22 mRNA在胃癌组织表达量为0.8562±0.141,在14例正常对照标本中为0.3163±0.216,二者差异有显著统计学意义（见表2）.在14对胃癌与正常配对标本中,有10对胃癌及正常组织中SM22基因均表达阳性而且在肿瘤组织中表达量明显高于正常组织.4对标本中SM22 mRNA只在肿瘤组织中表达而在正常组织中不表达（见图1）.
    图1  SM22反转录PCR结果    M：DNA标准带（DNA markers）；T1~7为胃癌组织；N1~7为相应配对正常组织；每个反应体系均以GAPDH为内对照,片段大小为472bp表1  SM22mRNA在胃癌及正常组织中的表达率情况表2  SM22mRNA在胃癌及正常组织中半定量表达情况
    3  讨论
    胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一［1］,大量资料表明胃癌发生可能与p53、c-myc、bcl2等基因有关［2］,但其确切的分子机制尚不明确.因此,鉴定与胃癌发生相关的新基因,对了解胃癌发生的机制有重要意义.SM22蛋白质主要集聚于血管平滑肌［5］.对SM22影响平滑肌细胞的分化和增殖的机制,已经有了相当深入的研究［6,7］.但也有研究表明SM22基因在许多非平滑肌细胞中广泛表达［8］,有关SM22基因与胃癌发生、发展的关系,目前尚未明确.有研究发现SM22蛋白在胃癌中表达上调［4］.本课题组在前期研究中利用双向电泳检测配对胃癌组织发现SM22蛋白在肿瘤组织中的表达明显高于正常对照组织.本研究采用RT-PCR方法发现SM22 mRNA的表达量在胃癌组织中较高,且与正常对照相比有统计学意义（P＜0.01）,提示SM22在胃癌发生中的作用是不容忽视的.
    SM22基因的5′端有445个碱基长的片段,其中含有两个CAnG（CCAAAAAAGG）盒和一个TATA盒的启动子.GAnG盒在很大程度上调控SM22的转录.SRF（serum response factor）是一个CAnG盒的特殊结合蛋白质,SRF-CAnG之间的相互作用受制于若干细胞信号通路的调节,从而进一步影响到SM22的转录.Ras的信号通路是激活SRF-CAnG的一个重要途径之一,Ras基因突变可扰乱细胞代谢和信号传递通路,刺激生长或分化,可导致细胞的恶性转化［9,10］.除了信号通路的调控外,SM22蛋白自身的某些生物化学性质,也可能成为将来研究其致癌机制的方向［11］.有关SM22基因与肿瘤的分子机制的研究还刚刚起步,研究中我们发现SM22基因在胃癌及对照组织中的阳性表达率的差异无统计学意义（P＞0.05）,而它在胃癌和对照组织中的表达量却有明显统计学意义（P＜0.01）,提示SM22基因的单纯表达率也许并不是特别重要,但它在胃癌和正常组织中表达量的差异,可能是我们特别要关注的.关于胃癌发生中SM22基因高表达的具体原因还有待于进一步研究探讨.综上所述,SM22可能与胃癌的发生有一定的关系,有可能成为诊断胃癌的分子标志物.
    【参考文献】
    1  Parkin DM. Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol,2001,2:533-543.
    2  Delchier JC, Ebert M, Malfertheiner P.Helicobactor pylori in gastric lymphoma and carcinoma. Curr Opin Gastroenterol,1998,14:41-45.
    3  Fuchs CS, Mayer RJ. Gastric carcinoma. N Engl J Med,1995,6:32-41.


    4  Klade CS, Voss T, Krystek E,et al. Identification of tumor antigens in renal cell carcinoma by serological proteome analysis. Proteomics,2001,1（7）:890-898.
    5  Blanca Camoretti-Mercado, Sean M Forsythe, Michelle M LeBeau, et al. Expression and cytogenetic localization of the human SM22 gene（TAGLN）. Genomics,1998,49:452-457.
    6  Lees-Miller JP, Heeley DH, Smillie LB. An abundant and novel protein of 22 kDa （SM22） is widely distributed in smooth muscles. Purification from bovine aorta. Biochem J,1987,15:705-709.
    7  Gimona M, Sparrow MP, Strasser P,et al. Calponin and SM22 isoforms in avian and mammalian smooth muscle: absence of phosphorylation in vivo. Eur J Biochem,1992,205:1067-1075.
    8  Lawson D, Harrison M, Shapland C. Fibroblast transgelin and smooth muscle SM22 alpha are the same protein, the expression of which is down-regulated in many cell lines. Cell Motil Cytoskeleton,1997,38:250-257.
    9  S Kim, HS Ip, MM Lu, et al. A serum response factor-dependent transcriptional regulatory program identifies distinct smooth muscle cell sublineages. Mol Cell Biol,1997,17:2266-2278.
    10  Barbacid M. Ras genes. Am Rao Biochem,1998,56:779.
    11  Fu Y, Liu HW, Forsythe SM, et al. Mutagenesis analysis of human SM22: characterization of actin binding . J Appl Physiol,2000,11:1985-1990.