结直肠癌为常见多发的消化道恶性肿瘤,随着生活水平的提高和饮食习惯的改变,结直肠癌的人群患病率有所上升,并有年轻化趋向.全国每年约有新发结直肠癌病例13万.已经跃居我国恶性肿瘤死亡率的第四位.长江下游与东南沿海的江苏、浙江、上海、福建、台湾和香港地区是结直肠癌高发区.浙江省肿瘤医院资料显示,近9年来收治率增加98%,平均每年增加10.9%.与90年代初相比,收治率则增加515%.
    目前,结直肠癌患者尽管接受了以手术为主的根治术,但临床上仍有50％的结直肠癌患者死于术后的肿瘤局部复发和转移, 成为手术治疗失败的主要原因[1,2].因此应用先进的分子生物学技术、建立定量荧光RT-PCR方法检测结直肠癌肿瘤标志物、术后转移的早期诊断受到高度重视.癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）是分子量为180000的细胞表面糖蛋白,是结直肠癌细胞去分化过程中表达的一个重要标志,是最有价值的肿瘤标志物之一.90％的结直肠癌、胃癌、胰腺癌有CEA的高表达.自1965年应用于临床以来已作为胃肠道肿瘤的诊断和判断预后的监测指标.CEAmRNA指标可确定结肠癌及直肠癌是否发生肝转移.本研究应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RT?PCR）技术,检测结直肠癌患者手术腹腔冲洗液中游离细胞的癌胚抗原(CEA)mRNA特异性标志物,并检测3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参因子[3].结合术后对患者随访,研究结果将正确诊断肿瘤侵润程度和复发可能性,对结直肠癌术后转移的早期诊断有重要意义.同时为肿瘤患者术后放疗、化疗方案确定提供参考依据,以提高患者生活质量和患者生存率.
1、病例和方法
1.1  细胞株：
    人结肠癌肝转移表达CEA中分化腺癌细胞株,由日本爱知癌症中心癌症研究所肿瘤病理实验室建立,并培养于加入10%小牛血清（GIBCO BRL,Gaithersburg）,100 unit/mL青霉素和100 ug/mL链霉素的DMEM培养基（Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan）中.
1.2  病例收集：
    收集从2003年5月至2004年4月在爱知癌症中心手术的107例结直肠癌病例,其中包括60例结肠癌,45例直肠癌,以及2例结直肠双发癌.病例分期根据2001版UICC分期：10例0期,21例I期,34例Ⅱ期,31例Ⅲ期,11例Ⅳ期.病理类型为：高分化腺癌 4例,中分化腺癌 89例,低分化腺癌8例,黏液腺癌4例,未分化癌1例.
1.3  腹腔冲洗液的收集和保存：
    手术开始进腹后,立刻分别用100 mL生理盐水冲洗盆底,和膈下,轻微搅拌后回收冲洗液.离心（1800 r/min,5 min）,PBS重新冲洗游离细胞沉淀,溶解于Isogen溶液中(Nippon Gene, Tokyo, Japan),-80度保存至使用.其中一部分冲洗液同时常规Papnicolaou染色,以进行细胞学检查.
1.4  实时RT-PCR检测：
    应用随机引物和寡核苷酸引物检测腹腔冲洗液游离细胞CEA mRNA,CK?20 mRNA 和GAPDH mRNA,经细胞总RNA提取——cDNA合成——实时荧光定量RT?PCR步骤.寡核苷酸引物为：
    CEA引物： 5’?AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT,5’-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG;
    荧光探针：5’?TGAAATGAAGAAACTACACCAGG,5’-CTGCTATATCAGAGCAACCCCAA
    GAPDH引物：5’?TGAACGGGAAGCTCACTGG,5’?TCCACCACCCTGTTGCTGTA
    荧光探针： 5’?TCAACAGCGACACCCACTCCT,5’-CACCTTTGACGCTGGGGCT
    PCR 的扩增使用Roche的LightCycler扩增仪,总反应体积为10 ul包括：Taq DNA聚合酶,dNTP混合物和缓冲,(LightCycler DNA Master hybridization probes, Roche), 4.0 mM MgCl2, 0.25 uM引物D和E, 0.4 uM的探针,1 ul的模板cDNA,于Roche的毛细管中.95℃(10 秒)变性,50℃ -55℃ (10 s)淬火,72℃ (10 s)延伸,共50次循环,每次试验包括6个外对照管,1个阴性对照管,和未知浓度患者样品管.mRNA的定量可在LightCycler上与标准曲线对照后由软件自动计算得出.


1.5  统计分析：
    根据肿瘤浸润深度T,肿瘤分期,淋巴结转移,应用卡方检验进行组间CEA mRNA 值显著性的差异.无瘤生存率用Kaplan?Meier方法计算.
1.6  术后随访：
    所有病例均入全日本结直肠癌病例库并按照爱知癌症中心术后随访程序随访,无失访.随访截至日期到2005年12月31日.
2 、结果
2.1  常规细胞学检查：
    所有107例病例均做常规术中脱落学检查,只有2例（1.9%）诊断为阳性.
2.2  结直肠癌腹腔冲洗液中CEA水平：
    利用引物合成CEA mRNA在10个黏膜层和黏膜下层的早期癌中均未能检出. 根据以往在爱知癌症研究所的研究中,将界定值定在1.0. 大于1.0定为阳性,小于1.0定为阴性.从盆底和膈下收集的标本只要有一处CEA mRNA值为阳性,该病例定为阳性.
    应用实时荧光定量PCR, 共检测了107例腹腔冲洗液标本,RT-PCR阳性率为22.4%（24/107）.在pTis?1, pT2, pT3 和 pT4各组病例中,阳性率分别为0%, 0%, 26.8%（11/41）,76.5%（13/17）,(P<0.05),各组病例的平均值分别为：0,0,700.2, 1125.8.CEA mRNA平均值与淋巴结转移关系：CEA mRNA平均值在淋巴结转移阴性,淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为7.7%（5/65）,45.2%（19/42）(P<0.05),平均值为65.03,1687.05(P<0.01).CEA mRNA与肿瘤分期关系：在1,2,3,4期各组病例中,阳性率分别为0%, 14.7%(5/34),32.2%(10/31),81.8%(9/11),(P<0.05),各组病例的平均值分别为：0,124.32,776.36,1119.74(P<0.01).腹腔转移阳性病例的CEA mRNA平均值（1196.90）显著高于腹腔转移阴性病例（36.32）(P<0.01).
    5例有腹膜转移阳性的病例在镜下均诊断为pT3?pT4,其中只有一例常规细胞学检查结果为阳性（敏感度为20%）.而实时荧光定量PCR结果为阳性（敏感度为100%）.各种病理学因素,与CEA的关系见表1.表1  CEA和各种病理学因素关系
2.3  初步随访结果：
    随访时间平均为12个月（范围为6～20个月）,共有6例患者出现复发和转移,其中包括腹腔内转移2例,肝转移3例,肺转移1例.其中5例患者为CEA阳性,复发转移率为26.3%（5/19）（剔除5例阳性对照）.其中有一例,手术时未发现腹膜转移,但CEA和CK20均为阳性,3月后再手术行肝转移在切除时,探查确认腹膜转移.CEA阳性患者与阴性患者相比较,无瘤生存率有显著差异（P<0.01）.
3、讨 论
    3.1  结直肠癌治疗失败的原因之一即是腹腔转移.常规细胞学检查一直以来作为肿瘤腹膜转移的金标准,是肿瘤TNM分期以外的又一肿瘤预后因素,但Wind等[4]报道,常规细胞学检查并不能为结直肠癌提供预后信息.肿瘤在进行根治手术后病例仍出现复发,原因通常被认为是手术时腹腔内即已存在从肿瘤浆膜面脱落的癌细胞,而这些脱落细胞通过常规细胞学检查未被发现.本研究中,5例阳性对照病例（腹膜转移）病理学诊断为pT3, 其中只有一例常规细胞学为阳性,敏感度为20%,提示建立一种新型的能检出肿瘤微小转移,具备高度敏感和特异方法的必要性.以往有利用常规RT-PCR方法来检测脱落癌细胞,Aoki等[5]报道（2002）以CEA为标记物应用常规RT?PCR方法来检测脱落癌细胞,结果提示RT?PCR的结果与肿瘤的浸润深度有关.但常规RT?PCR方法有以下缺点[3]：（1）它是定性而不是定量的方法,因而缺少对于腹膜转移风险的定量预测.（2）基因扩增和随后的分析时间长,难以马上获得结果.（3）有一定的假阳性的发生率.文献报道CEA为(0～33%)[6～9].而荧光定量RT?PCR方法具有时间短（小于3小时）,能在手术结束之前完成.具有高度敏感性,能够检测出107个正常细胞中的个数级别肿瘤细胞,不但远远高于常规的检验方法,而且敏感性优于常规RT?PCR[3,10].而CEA是检测脱落癌细胞的特异性肿瘤标记物,因而通过检测CEA水平能够有效的监测结直肠癌腹腔的微转移.荧光定量RT?PCR技术有带来假阳性的风险.通过设定合理界值（本研究CEA为1.0）,能够将假阳性和假阴性控制在较低水平.通过实时荧光定量PCR技术,在CEA为标记物结果中,敏感度和特异度分别为100%,100%.


    是否要对CEA mRNA 的值进行标化,然后再比较,一直都有争论.为了标化CEA mRNA 的值,我们采用GAPDH mRNA定量测定来作为内对照,因为它反映了腹腔内脱落细胞的数量,并且与肿瘤的浸润深度无关.CEA:GAPDH 比值,与CEA的值一样,都与肿瘤的浸润深度显著相关,所以不必对CEA的值比照GAPDH值进行标化.这与之前在胃癌腹腔微转移研究中得到的结果是一致的.
    3.2  本研究的结果显示,通过引物合成CEA的阳性率以及数值,都与肿瘤的浸润深度pT显著相关(P<0.01),同时也于肿瘤的期别呈显著相关（P<0.01）.肿瘤的浸润程度越深,CEA的阳性检出率就越高.本研究同时也发现,腹腔冲洗液中CEA的水平,也与肿瘤淋巴结转移显著相关(P<0.01),以及肿瘤的肝转移显著相关（P<0.01）.这与之前Nakanishi等[11～14]在胃癌中的结果是一致的.提示随着肿瘤生长肿瘤细胞一方面外浸,另一方面则出现较高几率淋巴转移.而Aoki等[5]报道的采用常规PCR方法进行检测,CEA与淋巴结转移无关不一致.以往结直肠癌病例通过淋巴结进而导致腹膜播散的未见文献报道.本试验的5名腹膜转移阳性对照患者,肿瘤为pT3但区域淋巴结都伴广泛转移,并证实周围已经有腹膜播散.说明肿瘤细胞通过淋巴结转移进而导致腹膜播散的可能性仍存在.
    3.3  近年来对于肿瘤微转移的概念发生了改变,分为两大类：①孤立性肿瘤细胞（Isolate tumour cells,ITC）,定义为单个,多个孤立性细胞或成簇肿瘤细胞,但直径小于0.2 mm.②肿瘤微转移（Mircometastases）: 直径大于0.2mm肿瘤细胞团.ITC并不表现出形态学上的转移如穿透血管,淋巴窦,肿瘤细胞的增生以及基质反应.结局有可能发展成转移,也有可能被机体免疫所消灭[15～17].而荧光定量PCR能够灵敏的检测出ITC.Nakanishi等[11]报道胃癌腹腔冲洗液中CEAmRNA水平是胃癌的独立预后因素（总生存率,以及腹膜无复发生存率）.本研究的随访结果也看到如此倾向,手术后复发和转移的病例6例中有5例,其CEA的水平在第一次手术时为阳性,提示腹腔冲洗液中CEA的水平异常是肿瘤复发和转移的高危因素,与术后无瘤生存率密切相关,并有显著性差异.是否是结直肠癌独立预后因素,有待于更长期随访结果的获得后进行分析.
     检测肿瘤ITC的作用不限于此,也为肿瘤的治疗提供了一个新的思路.Kurebayashi等[18]在乳腺癌的动物模型,Chaudhuri等[19]在卵巢癌的动物模型,均证实微转移灶对于化疗的敏感性较大转移灶高,而Nakanishi等[20]在胃癌的腹腔转移裸鼠模型中证实:通过口服化疗制剂(TS?1)后,微转移灶可完全缓解甚至治愈,生存率高于腹腔大转移灶裸鼠.这就为临床治疗结直肠癌提供了一个新的策略,即分子水平的诊断（CEA的水平）以及随后的对于具有高危因素患者的辅助化疗.近年来随着新的化疗制剂的应用于结直肠癌术后的辅助化疗,结直肠癌的生存率有了一定程度的提高.能否将此技术与结直肠癌辅助化疗结合起来,有待于今后进一步研究.
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