【摘要】  目的  用高效液相色谱法测定注射用肌苷的含量.方法  采用Kromasil C18柱（5μm 4.6mm×250mm),以甲醇-水（10：90）作流动相,在248nm紫外波长检测.结果  肌苷在4.23～63.48μg/ml范围内有良好的线性关系（r=0.9999).低、中、高3个浓度的平均回收率（n=2）分别为101.4%、101.8%、101.1%,RSD为0.46%.结论  该法简便、快速、准确,可作为测定注射用肌苷中肌苷的含量.
   【关键词】  注射用肌苷；高效液相色谱法；含量测定
   【Abstract】  Objective  A high-performance liquid chromatography (HPLC) was established for the determination of inosine contents in injection.  Methods  Impurity in the inosine injection could be separated on Kromasil C18 colnmn (5μm 4.6mm×250mm) using methanol-water (10:90) as mobile phase and UV detector at 248nm.  Results  The linear range was 4.23～63.48μg/ml(r=0.9999).Average recovery in the lower,moderate and higher inosine concentration groups was respectively 101.4%,101.8% and 101.1%(n=2) with RSD of 0.46%.  Conclusion  The method is simple,rapid and accurate.
   【Key words】  inosine injection;HPLC;concentration determination 
    肌苷为微生物发酵制得的辅酶类药物,有改善机体代谢作用,临床用于各种类型的肝脏疾患、心脏疾患、白 细胞和血小板减少症、中心视网膜炎及视神  经萎缩等.有关标准规定  ［1］,注射用肌苷含量测定采用紫外分光光度计,该方法操作复杂、费时且专属性差.为了有效地分离降解产物,准确测定注射用肌苷含量,本文采用高效液相色谱法（HPLC）测定注射用肌苷中肌苷含量,获得满意结果.
    1  仪器与试药
    高效液相色谱仪：DIONEX P680 HPLC PUMP泵；DIONEX UVD170U紫外检测仪；Chromeleon Server Monitor工作站.
    肌苷对照品（含量99.2%,中国药品生物制品检定所）,注射用肌苷分别为山西（规格：0.3g批号20060101；2006126）；海南（规格：0.2g批号20051201）.甲醇为色谱纯,试验用水为重蒸馏水.
    2  色谱条件
    色谱柱：Kromasil C18(5μm 4.6mm×250mm);流动相：甲醇-水（10：90）；检测波长为248nm；流速1.0ml/min；柱温为25℃；进样量20μl.
    3  线性关系的考察
    3.1  对照品储备液的制备  精密称取对照品10.58mg,置100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀.
    3.2  标准曲线的绘制  精密吸取对照品储备液1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、15.0ml,分别置25ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,分别进样20μl,依法测定.以各溶液的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制工作标准曲线,肌苷的线性回归方程为Y=0.726X+0.068（r=0.9999,n=6),在4.23～63.48μg/ml浓度范围内呈现良好的线性关系.
    4  精密度试验
    取含量测定项下肌苷对照品溶液20μl注入液相色谱仪,重复进样5次,测定峰面积,结果肌苷峰面积的RSD为0.14%（n=5),表明本法精密度良好.
    5  重复性试验
    按供试品溶液制备方法处理同一批号样品5份,测得肌苷的平均含量为105.5%,RSD为1.3%（n=5),表明本法重复性良好.
    6  回收率试验
    精密称取已知含量的样品适量（约相当于肌苷50mg）,分别精密加入肌苷对照品约40mg、50mg、60mg,置100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀.精密量取2ml,置100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀.按样品含量测定相下方法测定并计算回收率,结果见表1.
    7  稳定性试验
    取含量测定项下肌苷对照品溶液20μl分别于0、2、4、6、8、12、24h测定,测得肌苷HPLC峰面积为0.9%,表明溶液在24h内稳定.  表1  回收率测定结果
    8  样品测定
    8.1  对照品溶液的制备  取“3.1”项下对照品储备液5ml置25ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液.
    8.2  供试品溶液的制备  取装量差异项下的内容物,混合均匀,精密称取适量（约相当于肌苷0.1g）,置100ml量瓶中,加水约70ml,充分振摇使肌苷溶解,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取2ml,置100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀.
    8.3  含量测定  精密量取“8.2”项下供试品溶液20μl注入液相色谱仪,记录色谱图,同法测定对照品溶液,按外标法以峰面积计算其含量.结果见表2.表2  样品测定结果
    9  讨论
    9.1  检测波长的选择  由于肌苷在酸性和高温条件下易分解为次黄嘌呤,且次黄嘌呤在249nm的波长处有最大吸收,肌苷的最大吸收波长为248nm［2］,故选择248nm作为检测波长.
    9.2  流动相的选择  参考文献［3］,并经过实验,选择了甲醇-水（10：90）为流动相,能将杂质（降解产物）与肌苷分离,且分离效果较好,保留时间合适.
    【参考文献】
    1  国家食品药品监督管理局.标准（试行）YBH12992004.
    2  李金屏.肌苷及制剂质量标准修订起草说明.2005年版药典增修订情况介绍.
    3  国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京：化学工业出版社,2005,二部：205.

相关阅读：
tRNA氨基酸接受末端在蛋白质生物合成及其精确性调控中的作用
较高的维生素B6及常见氨基酸的血浓度与较低的肺癌风险有关
高效液相色谱、超滤系统、电泳系统等招标（中国医科大学）
干细胞研究必看：Cell干细胞综述特辑