复方斑蝥注射液是从斑蝥、刺五加、黄芪、人参等中药中经现代独有的高科技工艺提取的新型多靶点抗肿瘤药,具有抗肿瘤和免疫调整双重作用,在临床上得到了广泛的应用.目前,复方斑蝥注射液在人卵巢癌细胞株A2780,人肺癌A549细胞,人胰腺癌细胞中研究较多［1-3］.本研究主要观察该药在体外对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响.

1 材料与方法    
　　1．1 主要试剂    
　　人大肠癌细胞株LOVO购自中科院上海细胞生物学研究所.细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基体系中,用含0.25%胰酶和0.02%∶1（V/V）混合的消化液进行传代,置37℃、5%CO2孵箱中培养.实验时选用对数生长期细胞.DMEM培养基、新生牛血清分别为Gibco和Hyclone公司产品.复方斑蝥注射液（以下简称Aidi）为贵州益佰制药股份有限公司产品.四甲基偶氮唑盐（MTT）购自Fluka公司,用PBS液配成5mg/ml的浓度,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后-20℃保存.流式细胞术(flow cytometry,FCM)用FITC标记的鼠抗人Fas单抗和鼠抗人Bcl-2单抗（FITC-conjugated mouse anti-human Fas monoclonal antibody and IgG1 isotype control,FITC-conjugated American Hamster anti-human Bcl-2 monoclonal antibody and American Hamster monoclonal IgG isotype control） 和Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit均为美国B-D Pharmingen 公司产品.
    
　　1.2 细胞毒性实验     
　　采用MTT法.将细胞密度调整为1.5×105个/ml,加入96孔无菌培养板内每孔100μl,置 37℃、5%CO2孵箱中培养24h后加药.实验组加复方斑蝥注射液,复方斑蝥注射液剂量分别为注射液原浓度（计为1）的1/32、1/16、1/8和1/4,对照组（control）加等体积生理盐水,空白对照组只有培养液不加细胞.每组3复孔.分别培养24h、48h和72h,加入MTT磷酸盐缓冲液(5mg/ml) 每孔10 l,继续培养4h,加入10％SDS(含0.01N HCL) 100 μl/孔,24h后用酶标仪（Bio-rad 680型）测定570~630nm波长吸光度值（A）,计算细胞生长抑制率(inhibitory rate,IR).IR(%)=［1-(实验组A值-空白对照A值)/（对照组A值-空白对照A值）］×100%.实验重复3次.
    
　　1.3 细胞凋亡检测    
　　以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基将细胞制成1.5×105个/ml的单细胞悬液,12孔培养板内每孔接种1ml.24h后加入药物,药物剂量设置同MTT实验,对照组（control）加等体积生理盐水.每一浓度设2个复孔,48h后收获细胞,4℃离心(1000r/min,10min)弃上清.冷PBS重悬,离心,弃上清,再次重悬离心,将细胞悬浮于100μl 1×binding buffer中,加入5μl Annexin V-FITC和20μl PI,轻轻混匀,避光室温反应15min,加入150μl 1×binding buffer到样品中,混匀后1h内上机检测.
    
　　1.4 Fas、Bcl-2蛋白表达的流式细胞术（FCM）检测    
　　以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基将消化下的细胞制成1.5×105/ml的单细胞悬液,6孔培养板内每孔接种2ml.24h后加入药物,药物剂量设置同MTT实验,对照组（control）加等体积生理盐水.每一浓度设2个复孔,48h后收获细胞.各组细胞均用PBS液洗涤2次（1000r/min,5min）,弃上清.细胞均分为4管,2管分别直接加入FITC标记的鼠抗人Fas单抗和同型对照各20μl,另2管细胞先用70%冷乙醇4℃固定24h,PBS离心（1000r/min,5 min）洗涤2次,分别加入FITC标记的鼠抗人Bcl-2单抗及同型对照各20μl.两者均室温避光反应30min,PBS漂洗2次（1000r/min,5min）后用400μl PBS液悬浮,经300目尼龙网过滤上机检测.

　　表1  复方斑蝥注射液对LOVO细胞的毒性作用（略）
    
　　1.5 FCM条件    
　　流式细胞仪为美国B-D公司FACS Calibur型,在power Macintosh G3型计算机上用Cell Quest软件FSC/SSC设门获取10000个细胞.Fas、Bcl-2表达用水平Cell Quest软件分析,结果以阳性细胞百分率表示.Fas或Bcl-2阳性细胞率（%）=标记阳性细胞数/受检细胞总数×100%-非特异标记细胞%.
    
　　1.6 统计学分析    
　　结果用SPSS(10.0)统计分析软件处理.采用t检验及相关分析.
    
2 结果    
　　2.1 复方斑蝥注射液对LoVo细胞的毒性作用    
　　LoVo细胞经不同剂量的复方斑蝥注射液作用后,代谢MTT的能力降低,显示一定的细胞毒性反应.复方斑蝥注射液对LoVo细胞的生长抑制率随药物浓度增加和作用时间延长逐渐升高,抑制作用呈现量效依赖性和时间依赖性（P<0.05）,结果见表1和图1.
　　图1  复方斑蝥注射液对LoVo细胞的毒性作用（略）


　　2.2 复方斑蝥注射液对LoVo细胞凋亡的影响    
　　用Annexin V FITC染色检测复方斑蝥注射液作用48h后的LoVo细胞,可观察到凋亡细胞出现,细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),结果见表2.图2为 Annexin V法检测复方斑蝥注射液诱导LoVo细胞凋亡的流式点图.其中I象限（左上）为PI 高染、FITC低染的坏死细胞,II象限（右上）为PI、FITC均高染的凋亡后坏死细胞和部分坏死细胞,III象限（左下）为PI、 FITC均低染的正常细胞,IV象限（右下）为PI低染、 FITC高染的早期凋亡细胞.凋亡率为第4象限细胞占全部细胞的百分率.

　　2.3 复方斑蝥注射液对LoVo细胞Fas和Bcl-2表达的影响    
　　由表3可见,复方斑蝥注射液处理48h后的LoVo细胞,Fas蛋白表达高于对照组（P<0.05）,高剂量复方斑蝥注射液组提升Fas蛋白作用大于低剂量组.Fas蛋白上调以复方斑蝥注射液 1/4剂量组最明显,为对照组的4倍.但Bcl-2表达在对照组与复方斑蝥注射液处理组未观察到显著差异（P>0.05）.图3为复方斑蝥注射液处理后的LoVo细胞Fas和Bcl-2表达的流式直方图.

　　表2  复方斑蝥注射液对LoVo细胞凋亡的影响（略）

　　表3  复方斑蝥注射液对LoVo细胞Fas、Bcl-2蛋白表达的影响（略）

　　图2  Annexin V法检测复方斑蝥注射液诱导LoVo细胞凋亡（略）

　　图3  LoVo细胞Fas和Bcl-2表达的流式直方图（略）

3 讨论    
　　复方斑蝥注射液内含斑蝥、刺五加、黄芪、人参等多种成分,具有抗肿瘤和免疫调节作用.研究表明,上述药用成分对各类肿瘤细胞具有明显抑制作用,其抑制作用或通过阻抑DNA复制与合成［４］,或通过下调VEGFmRNA和蛋白的表达,降低微血管密度而阻止血管生成,抑制肿瘤生长［５,６］,或特异阻滞细胞周期,直接杀伤肿瘤细胞［７］.本实验结果显示,复方斑蝥注射液对人大肠癌细胞株LoVo细胞有抑制作用,并随着药物浓度的增加其抑制作用增强.应用Annexin V FITC染色检测该药作用48h后的LoVo细胞,可观察到凋亡细胞出现,该结果与文献报道一致［２］.应用流式细胞仪检测复方斑蝥注射液处理48h后的LoVo细胞,Fas蛋白表达高于对照组（P<0.05）.结果提示复方斑蝥注射液可能通过上调Fas蛋白水平诱导LoVo细胞凋亡,与曹唯希等［８］研究结果一致,为大肠癌患者的临床治疗提供了一个新思路.本研究Bcl-2表达在对照组与复方斑蝥注射液组未观察到显著性差异（P>0.05）,与有关文献结果不同［２］,提示复方斑蝥注射液诱导LoVo细胞凋亡的机制可能与Bcl-2蛋白无关,其具体机制有待于进一步观察研究.

【参考文献】
  　1 刘德艳,李辅军,王常玉,等.复方斑蝥注射液及联合应用化疗药物抑制人卵巢癌细胞株A2780增殖的研究［J］.现代妇产科进展2005；1(14)：47~48　
　　2 张卫东,赵惠儒,阎影,等．斑蝥素诱导人肺癌A549细胞凋亡及其分子机制的研究．中华肿瘤杂志,2005；27（6）：330~334
　　3 周季兰,姚玮艳,章永平,等.斑蝥素诱导人胰腺癌细胞凋亡的实验研究.胰腺病学,2006；6(6):340~343
　　4 何太平,莫丽儿,梁念慈,等,斑蝥素诱导高转移卵巢癌细胞HO-8910PM凋亡的研究.中国医科大学学报,2005；36(2):164~167
　　5 Zhang JP,Ying K,Xiao ZY,et al.Analysis of gene expression profiles in human HL-60 cell exposed tO cantharidin using cDNA microarmy［J］．Int J Cancer,2004；108(2)：212~218
　　6 陶厚权,姚明,邹寿椿,等.血管生成抑制剂Rg3对胃癌生长和转移抑制作用的实验研究［J］.中华外科杂志,2002,40:606~608
　　7 沈括,冯建明,刘昕,等.复方斑蝥注射液对K562／ADM细胞体外生长和增殖周期的实验研究［J］.中华实用中西医杂志,2005；18(23):1857~1860
　　8 曹唯希,王亚平,刘琼,等人参皂甙诱导白血病细胞凋亡及对Fas、FasL表达的影响,第三军医大学学报,2005；27（6）：525~528