在肿瘤的侵袭和转移过程中有大量的分子介入,其中一些关键的因子和机制还有待证实［1］.已有研究证实,RhoC基因的表达水平与癌细胞的侵袭潜能密切相关[2],且As2O3有一定的抗肝癌细胞黏附和侵袭作用[3],但As2O3抗肝癌侵袭转移的机制尚不十分明了.本研究观察了As2O3对HepG2细胞体外侵袭、迁移的抑制作用及对转移基因RhoC表达的影响,旨在探讨As2O3抑制肿瘤转移的分子机制.
1、材料和方法
1.1  材料
    人肝癌细胞株HepG2由华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科实验室惠赠；0.1%As2O3(10mg/支)为哈尔滨伊达药业有限公司产品；带有8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell细胞培养小室、Matrigel胶和羊抗人RboC多克隆抗体分别购于美国Costar、BD和Santa Cruz公司.自动酶标读数仪,Bio Rad 550型,波长492nm,美国.
1.2  方法
1.2.1  细胞培养
     HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养,以0.25％胰蛋白酶常规消化,按所需浓度接种[4].
1.2.2  MTT法检测As2O3对HepG2细胞黏附能力的影响 
    取对数生长期HepG2细胞配成浓度为1×105/ml的细胞悬液,常规培养.参照文献[5]以MTT法测定细胞黏附能力.实验组为0.25mg/L As2O3,对照组为含10%胎牛血清的DMEM.各组细胞分别在30、60、90、120min时吸出悬浮的、未黏附的细胞,测定每孔OD值.细胞黏附率=（处理组平均OD值/对照组平均OD值）×100％.黏附抑制率=[1-（处理组平均OD值/对照组平均OD值）]×100％.
1.2.3  Transwell检测As2O3对HepG2细胞迁移、侵袭能力的影响
     Transwell小室杯底由8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜封闭.体外侵袭能力的测定时侵袭小室的滤膜不用Matrigel覆盖.实验参照文献[5]改良.下室加入0.5ml含20%血清培养,上室加入细胞悬液（2×106/ml,200μl/每孔）,各设3个复孔.实验组为0.25mg/L As2O3,对照组为含10%胎牛血清的DMEM.各组常规培养、孵育、4%多聚甲醛固定、苏木精染色,镜下随机计数5个视野的穿膜细胞平均数（400×）.侵袭抑制率=（1－As2O3组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×100％
1.2.4  RT-PCR方法检测HepG2细胞中RhoC mRNA的表达 
    收集0.25mg/L As2O3作用4d、6d、8d后的细胞分别提取总RNA,行RT-PCR反应.参照文献[6]设计引物,RhoC和内参照β actin分别为183、587bp产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统分析电泳条带灰度值.RhoC mRNA 表达相对强度= RhoC条带灰度值/β actin条带灰度值.
1.2.5  Western blot检测HepG2细胞中RhoC蛋白的表达 
    取上述培养细胞常规细胞裂解、蛋白变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白电泳、转膜.PVDF膜先后置于1∶500稀释的一抗稀释液中37℃孵育1h,1∶1000稀释的二抗稀释液中孵育,PBST洗膜后加入DAB显色.
1.3  统计学方法
    采用SPSS 13.0统计软件,细胞生长抑制率用F检验,计量资料的组间比较采用t检验.
2、 结果
2.1  As2O3对HepG2细胞黏附的影响
    As2O3对HepG2细胞黏附力的影响,见表1.实验组各时段的细胞黏附率均明显低于对照组（P＜0.05）,各时段黏附抑制率分别为33.6%、23.7%、22.5%和20.0%,各时间段之间差异无统计学意义（P＞0.05）.表1  MTT法检测As2O3对HepG2细胞黏附率的影响
2.2  As2O3对HepG2细胞迁移、侵袭的影响
    As2O3组迁移细胞数及侵袭细胞数均明显低于对照组,迁移抑制率和侵袭抑制率分别为55.19%和58.21%,见表2.对照组细胞轮廓清晰,活力旺盛,As2O3组细胞明显变圆,稀疏.表2  As2O3对HepG2细胞迁移力和侵袭力的影响
2.3  As2O3对肝癌HepG2细胞中RhoC基因表达的影响
    As2O3作用前RhoC mRNA表达量为（1.40±0.44）,0.25mg/L的As2O3作用4d、6d、8d后,RhoC mRNA表达量分别降为（0.66±0.21）、（0.50±0.19）和（0.38±0.13）,各时间段表达水平均明显低于药物作用前（P＜0.05）；此外,As2O3作用前及作用后4、6、8d,RhoC蛋白量分别为（2.40±0.22）、（1.64±0.31）、（1.54±0.29）和（0.74±0.17）,各时段与用药前RhoC蛋白表达比较差异也有统计学意义（F=13.7,P=0.033）,见图1、2.
2.4  HepG2细胞中RhoC基因mRNA和蛋白表达的相关性分析
    使用双变量相关分析统计RhoC基因mRNA和蛋白表达之间的关系发现,HepG2细胞中RhoC基因mRNA的表达和蛋白含量存在正相关


3 、 讨论
    肿瘤的侵袭及转移是较为复杂的动态过程,是疾病进展的主要原因.Liotta[7]曾最早提出了侵袭转移过程的“三步”假说：黏附、降解与移动.本研究在对肝癌细胞系HepG2细胞的研究中发现,HepG2细胞黏附率在120min时高达91.30%,迁移和侵袭细胞数分别为（221.67±7.37和(156.34±13.50).提示HepG2细胞具有较强的黏附能力和较强的侵袭和转移能力,表明本株肝癌细胞株具有转移倾向.As2O3可使其黏附抑制率明显下降,且随着时间的延长,黏附能力无恢复迹象.同时As2O3可使迁移细胞数及侵袭细胞数分别下降为（99.33±3.51）和(65.33±6.66),其抑制率分别为55.19%和58.21%,并可使细胞形态发生明显的改变.提示As2O3可降低肝癌HepG2细胞异质黏附能力,阻止侵袭转移的发生,且抑制作用具有不可逆性.此外,As2O3能通过穿过聚碳酸脂膜的肝癌细胞数量减少,降低肝癌细胞的侵袭和运动能力.因此,As2O3除诱导肝癌细胞凋亡、抑制增殖、抗肿瘤血管形成作用外,还具有抑制肝癌细胞转移的作用.
    肿瘤细胞的侵袭和转移能力是恶性肿瘤最基本的特性,肝癌细胞的黏附和侵袭是肝癌发生转移的重要步骤,抑制肝癌细胞的侵袭可能降低肝癌转移的发生.本研究结果提示As2O3可能是很有前途的抑制肿瘤转移复发的药物.这为As2O3在临床上用于肝癌的治疗提供了新的思路.
    现已明了,RhoC是小分子G蛋白超家族中Rho亚族的蛋白之一.近年来,诸多研究结果表明［6,8］,RhoC基因的表达水平与癌细胞的侵袭潜能相关.Rho 相关的细胞内信号决定着恶性肿瘤的转移潜能[6,9].我们在本研究中观察到As2O3作用后RhoC?mRNA表达水平及蛋白水平均有不同程度的下降,其下降呈时间依赖,且As2O3对RhoC基因的调节作用在RhoC基因mRNA和蛋白水平上有一致性,下调RhoC表达的同时伴随着肝癌细胞迁移、侵袭的抑制.该结果提示As2O3对高表达的RhoC基因均有不同程度的下调作用,下调RhoC的表达可明显抑制肝癌细胞的迁移与侵袭.
    已知As2O3是一种细胞毒药物,我们的前期研究中观察到,As2O3能抑制细胞增殖、诱导凋亡、逆转耐药[10].本实验中我们进一步观察到,As2O3还具有抑制侵袭转移的作用,且其抑制侵袭转移的作用与下调RhoC基因的表达有关.因此,As2O3的抗肿瘤作用可能是多途径的,针对RhoC基因的靶向治疗可能是肝癌治疗的新思路.
【参考文献】
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［3］ 华海清,秦叔逵,王锦鸿,等.三氧化二砷对人肝癌细胞黏附和侵袭影响的实验研究［J］.中国中西医结合杂志，2004，24（10）:922 925.
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［5］Yao Z,Che XC,Lu R,et al.Inhibition by Tyroserleutide (YSL) on the Invasion and Adhesion of the Mouse Melanoma Cell ［J］.Mol Med,2007,13(1 2):14 21.
［6］ Shikada Y,Yoshino I,Okamoto T,et al.Higher Expression of RhoC Is Related to Invasiveness in Non Small Cell Lung Carcinoma［J］.Clin Cancer Res,2003,9(14):5282 5286.
［7］ Liotta LA.Tumor invasion and metastasis role of the extracelluar matrix： Rhoads Memorial Award lecture［J］.Cancer Res,1986，46(1)：l 7.
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［10］冯觉平,孔庆志,黄涛,等.三氧化二砷对肺腺癌耐药细胞A549/R耐药性的影响［J］.中华实验外科杂志，2006，23（2），201 203.