EB病毒潜伏期膜蛋白(Latent membrane protein1,LMP1)是目前唯一被证实具有癌基因编码蛋白特性的EB病毒基因产物。体外实验表明，LMP1对啮齿类动物的纤维母细胞有转化作用，表达LMP1的Rat-1细胞在裸鼠体内具有成瘤性。LMP1还能诱导转基因小鼠皮肤表皮增生，并可抑制表皮细胞的终末分化[1]。但在与EB病毒密切相关的人体鼻咽癌组织中，LMP1是否影响鼻咽癌细胞增殖和凋亡的生物学过程，与影响细胞增殖和凋亡的p53和bcl－2表达之间是否存在联系，目前尚未见有关报道。本文旨在对上述问题作一初步探讨。

1　材料和方法

1.1材料

　　36例和18例未经治疗的鼻咽癌活检组织分别取自中山医科大学肿瘤医院病理科和病理教研室，病理组织学诊断均为鼻咽非角化性癌(NKC)。临床分期(UICC)属T1～2N0M0者24例，
T1～2N1～3M0者30例。患者均为广东籍居民，年龄最大者69岁，最小者29岁，平均年龄46-8岁，男女性别比为2.4∶1。取该54例鼻咽癌石蜡包埋组织作4μm厚切片及免疫组化和凋亡细胞检测。

1.2免疫组化法

　　采用常规LSAB法。LMP1(OT17-2)单克隆抗体为Organon Teknika公司产品，由Dr.Middeldorp JM惠赠，工作稀释度为1∶50；PCNA、p53、bcl-2抗体均为Dake公司产品，工作稀释度分别为1∶100、1∶80、1∶80；以B95-8细胞涂片作LMP1阳性对照，以封闭血清(bolocking)代替一抗作阴性对照。阳性标准：阳性染色为明确的棕黄色细颗粒状。LMP1为胞膜和胞浆阳性；p53和PCNA为胞核阳性；bcl-2为胞浆阳性。根据各观测指标阳性细胞比率均数大致确定分级标准。LMP1阳性细胞≥5％者为阳性，≤4％者为阴性；PCNA阳性细胞>50％者为+++，25％～49％为++，1％～24％为＋；p53和bcl-2以阳性细胞比率≥25％为阳性，<25％为阴性。

1.3细胞凋亡原位检测方法

　　本实验采用末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标记法(TUNEL)，检测试剂盒为Boehringer Mannheim公司出品。碱性磷酸酶底物(BCIP/NBT)为Dako公司产品。蛋白酶K(PK)为Sigma公司产品。方法：切片经脱蜡、水化后滴加PK液(30μg/ml,10mmol/LTris/HCl,pH7-4)，37℃温箱内孵育15分钟。用PBS洗去PK液后滴加TUNEL反应液，37℃孵育1小时。PBS洗去反应液后滴加碱性磷酸酶联接的抗荧光素抗体(Converter-AP)，37℃孵育30分钟。滴加碱性磷酸酶底物(BCIP/NBT)，室温下反应15～20分钟。水洗后用2％甲基绿复染，中性树胶封片，光镜下观察。以反应性增生的淋巴结作细胞凋亡原位检测阳性对照。阳性结果判断标准：凋亡细胞胞核和/或胞浆内出现蓝紫色颗粒。细胞凋亡程度分级标准：光镜下用高倍视野对每例组织切片中癌组织区域连续数1000个细胞，计算其中阳性细胞所占比率，阳性细胞比率>10％为+++；4％～9％为++；1％～3％为＋。

1.4统计学方法

　　采用OXSTAT-II(Version4.0WalterSJ.)统计软件作统计分析。

2　结果

　　免疫组化方法检测54例鼻咽癌，其中LMP1阳性者占48.1％(26/54)(图1)；PCNA在癌细胞中均呈不同程度的阳性，p53阳性率为75.9％(41/54)，p53阳性者多属未分化癌，癌细胞异型性较大(图2)。bcl-2阳性率为75.9％(41/54)，除癌细胞阳性外，间质部分淋巴细胞也呈阳性(图3)。p53和bcl-2共同表达阳性者占64.8％(35/54)，两者均阴性者为12.9％(7/54)。
本文来自: 医学论文(yxlw.org) 详细出处参考：http://www.yxlw.org/html/qita/zhongliu/20091006/23828.html

2　结果
　　免疫组化方法检测54例鼻咽癌，其中LMP1阳性者占48.1％(26/54)(图1)；PCNA在癌细胞中均呈不同程度的阳性，p53阳性率为75.9％(41/54)，p53阳性者多属未分化癌，癌细胞异型性较大(图2)。bcl-2阳性率为75.9％(41/54)，除癌细胞阳性外，间质部分淋巴细胞也呈阳性(图3)。p53和bcl-2共同表达阳性者占64.8％(35/54)，两者均阴性者为12.9％(7/54)。

　　用TUNEL方法原位检测凋亡细胞，见凋亡细胞多呈单个散在分布，也可见数个凋亡细胞呈小灶性聚集；凋亡细胞核多呈边缘不规则紫蓝色团块状和松散细颗粒状；少数凋亡细胞核仍保持圆形或卵圆形，阳性信号呈浅紫蓝色定位于核内(图4)。根据凋亡细胞所占比率确定细胞凋亡程度的分级，在54例非角化性癌中，1＋者占24.1％(13/54)；2＋者占33.3％(18/54)；3＋者占42.6％(23/54)。

　　以增殖细胞核抗原(PCNA)表达强度反映癌细胞的增殖活性。经统计学分析，LMP1表达与否在癌细胞增殖方面的差异无显著意义，但在癌细胞凋亡程度方面的差异有显著性意义，表明LMP1阴性者癌细胞凋亡程度低，LMP1阳性者则癌细胞凋亡程度高(见表1)。
                
                 表1　LMP1的表达与癌细胞增殖活性、凋亡程度的关系

<link rel="File-List" href="file:///C:DOCUME~1ADMINI~1LOCALS~1Tempmsohtml1