胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,约占所有颅内肿瘤的40%,手术、化疗与放疗等疗效均不理想,平均存活期仅为9~12月.目前国内、外许多学者广泛开展脑胶质瘤基因治疗研究,并取得初步效果.胞嘧啶脱氨酶(cytosine deamimase,CD)是存在于大肠杆菌和真菌中的一种代谢酶,哺乳类细胞不含该酶,此酶可将原药5-氟胞嘧啶（5-flucytosine,5-FC）代谢为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)从而导致肿瘤细胞自杀性死亡.若将CD基因转染肿瘤细胞,则赋予肿瘤细胞酶解5-FC为5-FU的特性,以降低直接给予5-FU所发生的毒副作用.本研究即以含CD基因的重组质粒介导转染人脑胶质瘤SHG-44细胞,观察5-FC对基因修饰的SHG-44细胞凋亡的影响作用,以探讨其在脑胶质瘤基因治疗中的意义.
   
1  材料和方法
1.1  菌种、质粒和细胞株 
    大肠杆菌Escherichia coli DH5α和 SHG-44 人多型性胶质母细胞瘤细胞株(SHG-44 细胞) 购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所,培养于含10%FBS的DMEM培养基.含胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因的pCMVCD 质粒由日本 Yoshimura I 博士构建并惠赠.
   
1.2  主要试剂 
    限制性内切酶 Bam HI 和 Not I 购自 New England BioLabs Inc, (USA).pcDNA3.0 购自 Invitrogen.Lambda DNA/Hind III Marker 购自华美生物技术有限公司.E.Z.N.A.(r) 质粒抽提试剂盒购于 Omega (USA).脂质体Lipofectamine2000 和G418 购自 Gibco/BRL (USA).DMEM培养基和胎牛血清FBS均为 Hyclone (USA)产品.5-FC,MTT购自Sigma, 绵羊抗人的CD多克隆抗体购自英国 Biogenesis公司.
   
1.3  方法
    1.3.1  质粒pCMVCD扩增鉴定和细胞转染 
    常规制备大肠杆菌DH5α感受态细胞,质粒pCMVCD转化、提取,酶切鉴定和基因测序.细胞培养： SHG-44 细胞在 含10% FBS的 DMEM培养液中,于37 ℃,50ml/LCO2条件下进行培养.细胞转染CD基因：采用脂质体Lipofectamine2000试剂进行转染.转染前两天将SHG-44细胞接种于6孔培养板内,当细胞覆盖率达90%左右时,将制备的质粒pCMVCD 与 Lipofectamine2000混合物,加入六孔培养板中,均匀分散.24 h后换成含200 μg/ml G418 培养液继续培养；1周后,倒置显微镜下观察见非转染组细胞全部死亡,转染组细胞约有5%~10%存活；继续培养,转染组细胞开始积聚成片状,2~3周后生长融合成抗G418的阳性细胞克隆,挑选pCMVCD细胞克隆,继续在含G418的培养液内培养,取名为 SHG-44/CD 细胞.
    1.3.2  免疫细胞化学检测CD基因蛋白表达［1］  制备转染与未转染CD基因的SHG-44/CD细胞和SHG-44细胞玻片,以CD多克隆抗体检测CD基因蛋白表达.
    1.3.3  细胞毒性实验  采用四唑盐比色（MTT）法［2］.SHG-44/CD和SHG-44 细胞接种到96孔板内（每孔2000个细胞,每组6孔）.第二天用含不同浓度的5-FC和5-FU的培养液更换原培养液.培养第7 d,细胞毒性实验采用常规MTT法进行比色分析,波长为490 nm ,以不加药物为对照组.计算细胞存活比率［3］：细胞存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%,一般可用细胞存活率对剂量对数作图法求出IC50值.
    1.3.4  原位细胞凋亡检测（TUNEL）  将SHG-44/CD和SHG-44细胞接种至玻片,加入含5-FC的培养液（5-FC设置浓度分组：0,10,100 umol/L）, 72 h后开始进行凋亡检测.室温下4%甲醛固定玻片细胞1 h.PBS冲洗3次,4℃渗透液孵育2 min.PBS冲洗3次,晾干,每片加50 μl的TUNEL混合液,37℃湿盒孵育2 h,荧光显微镜下观察.
    1.3.5  电镜观察  将SHG-44/CD和SHG-44细胞分别接种于培养瓶内,常规培养.待细胞长至覆盖率达80%左右时,弃掉旧培养液,更换成含5-FC的培养液（5-FC设置浓度分组：0,10,100 μmol/L）,移入孵箱内继续培养72 h.收集SHG-44/CD和SHG-44肿瘤细胞,加入3%戊二醛固定,1%四氧化锇后固定,丙酮逐级脱水,Epon812包埋细胞.细胞标本超薄切片,行醋酸铀及枸橼酸铅双重染色,H-600IV型透射电镜观察细胞形态.
    1.3.6  流式细胞仪检测  将SHG-44/CD和SHG-44细胞分别接种于培养瓶内,常规培养.待细胞长至覆盖率达80%左右时,弃掉旧培养液,更换成含5-FC的培养液（5-FC设置浓度分组：0,1.0,10.0,100 μmol/L）,移入孵箱内继续培养72 h.收集SHG-44/CD和SHG-44肿瘤细胞,70%乙醇固定过夜（4℃）,碘化丙啶（PI）进行细胞DNA染色.将细胞样本送入EPICS Elite-EPS型流式细胞仪,检测细胞凋亡、细胞周期时相,数据用仪器自带软件收集储存分析.PI阴性为活细胞,阳性为凋亡细胞.以特异性肿瘤细胞凋亡峰面积占总峰面积的百分数,即凋亡率作为评价指标.
 

1.4  统计处理  应用SPSS11.5软件进行统计学处理.以±s表示,进行方差分析和t检验.以P<0.05为有显著性差异,P>0.05为无显著性差异.
   
2  结  果
 2.1  质粒pCMVCD酶切鉴定  

    限制性内切酶Bam HI 和 Not I消化证实CD基因插入真核表达载体的多克隆位点,电泳结果显示为1 500 bp的CD基因片段和5 400 bp的pcDNA3.0片段（图1）.基因序列测定CD基因编码区为1 284 bp,与基因库收录序列一致［4］.
    图1  pCMVCD质粒酶切电泳量定  图2  SHG-44/CD细胞CD抗体免疫染色, ×400
    
2.2  SHG-44/CD转染细胞的CD蛋白表达 

    经脂质体介导转染和G418筛选,获得了含CD基因的SHG-44/CD细胞.CD抗体免疫细胞化学染色显示SHG-44/CD细胞能够较强表达CD（图2）.
   
2.3  SHG-44/CD细胞对5-FC的敏感性(MTT试验) 

    选择SHG-44细胞为对照.结果显示SHG-44细胞对5-FC不敏感,其IC50 约为 6 500 μmol/L；转染CD基因的SHG-44/CD细胞体外对5-FC高度敏感,其IC50 为 10 μmol/L,二者之间具有显著性差异（P＜0.05）（图3）.
    图3  5-FC对SHG-44/CD和SHG-44细胞生存率的影响
   
2.4  Tunel改变 

在5-FC的作用下,转染CD基因的SHG-44/CD细胞可以检测到大量的凋亡信号（图4,5）.
    图4    图5  5-FC作用SHG-44/CD细胞产生的凋亡信号（×200和×400）
   
2.5  形态学改变 

    转染CD基因的SHG-44/CD细胞在含10和100μmol/L5-FC的培养液中培养72 h,镜下可见凋亡形成的特征性改变：细胞体积缩小,胞膜皱缩、起泡、发芽,染色质浓缩并凝集成块,出现致密的染色质沿核膜内侧排列的核边集现象（图6）.
    在100 μmol/L5-FC组中可观察到部分细胞出现核碎裂、核膜不完整的坏死现象（图7）.同样条件下,未能观察到SHG-44细胞的凋亡形态改变.
    图6  5-FC作用SHG-44/CD细胞,核固缩、核边集（透射电镜×8000）   图7  坏死SHG-44/CD细胞,（5-FC100 μmol/L,透射电镜×8000）
   
2.6  流式细胞仪检测结果 

    流式细胞仪DNA含量分析结果显示,5-FC作用于SHG-44和SHG-44/CD细胞72 h后,作为对照的SHG-44细胞凋亡率为2.1%,而SHG-44/CD细胞的凋亡率最高可达18.6%,与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）,其凋亡率也随5-FC浓度的增加而递增,呈现出剂量依赖性（图8～13）,并且与对照组相比,SHG-44/CD细胞周期各时相分布出现变化,细胞阻滞于G1期（P＜0.05）,S期细胞减少,5-FC对SHG-44/CD细胞凋亡的诱导呈现剂量依赖性,且出现细胞周期分布改变(表1).表1   5-FC对SHG-44/CD细胞凋亡和细胞周期的影响注:#P＜0.05 （与对照组比较）

  3  讨  论
    细胞增殖和细胞凋亡是生物体正常生存的关键环节,这两个环节发生异常都有可能引起肿瘤的发生.诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要机制.在CD/5-FC基因治疗系统中,5-FC转换为5-FU,后者对细胞具有高度毒性,可以诱导细胞出现凋亡.


    目前,脑胶质瘤自杀基因治疗主要采用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/无环鸟苷( HSV-tk /GCV ) 和胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）两种系统.CD/5-FC系统中的CD是由大肠杆菌等原核生物基因编码的一种嘧啶补救酶,它能将胞嘧啶转化为尿嘧啶.5-氟胞嘧啶(5-Fluorocytoine,5-FC)原先则是无细胞毒性的一种抗真菌药物,作为胞嘧啶类似物,能被CD转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU),干扰细胞DNA的合成.由于哺乳动物细胞中不存在CD,因而不能将胞嘧啶转化成尿嘧啶,更不能将5-FC转化成5-FU.但通过基因转移技术将CD基因转入哺乳动物细胞,则哺乳动物细胞可将一些原来无毒性的原药(5-FC)转化为有细胞毒性的代谢产物(5-FU),导致细胞自杀性死亡,而5-FU具有高度细胞毒性,是临床广泛使用的抗肿瘤化疗药物.与5-FU不同,5-FC治疗剂量对人体毒副作用不大,口服容易通过血脑屏障,利于全身给药,为将来临床应用研究提供了更大的方便［5］.CD/5-FC自杀基因治疗系统已用于胃肠道肿瘤、胶质瘤等恶性肿瘤的实验研究,在胶质瘤的实验治疗研究中取得较好效果.该系统对胶质瘤的临床治疗具有潜在的应用价值.Aboody等［6］观察体外5-FC对培养的脑胶质瘤细胞生长抑制情况；接着在荷CNS-1胶质母细胞瘤裸鼠脑内接种肿瘤细胞,2周后腹腔注射5-FC,结果发现：离体情况下脑胶质瘤细胞的生长和荷瘤鼠脑内接种肿瘤生长均受到明显抑制.另外,CD基因系统在细胞转染CD基因后不仅杀伤转染细胞,同时通过“旁观者效应”（bystander effect）杀伤周围未转染CD基因的细胞［2,7］,其机制包括缝隙连接、细胞凋亡与免疫吞噬等［8］.CD基因还可联合其它基因治疗脑胶质瘤.Kim等［9］将HSV-tk与CD双基因构建于逆转录病毒载体联合治疗胶质瘤,发现疗效高于单自杀基因治疗.Wang［10］等将CD和tk基因与白介素-α基因联合,用于C6大鼠胶质瘤细胞株的离体和在体研究,发现上述联合方案对C6细胞的杀伤效果令人满意.本实验研究构建了针对人脑恶性胶质瘤细胞SHG-44的CD/5-FC自杀基因治疗系统以探讨其对胶质瘤的治疗作用.
    本研究从细胞凋亡的角度探讨了5-FC对CD基因修饰的SHG-44细胞生长抑制的可能机制,结果显示转导CD基因的SHG-44细胞对5-FC敏感性明显提高260倍以上.倒置显微镜观察HE染色细胞形态发现：转染CD基因质粒后的SHG-44/CD细胞体积增大、胞内颗粒和空泡增加、胞核亦明显增大,细胞仍为长梭状,呈平行或放射状生长.发生上述改变的机理尚不完全明确,可能与基因转移后细胞的基因组发生改变,导致蛋白表达相应变化有关［11］.SHG-44细胞和SHG-44/CD细胞在5-FC作用下,形态学有明显不同,7天后,SHG-44细胞生存状态良好, SHG-44/CD细胞胞体向两极延长,梭状更为明显,胞核浓缩,可见凋亡小体形成,出现典型的生长抑制和死亡现象.Tunel免疫细胞化学染色显示绝大多数转导CD基因的SHG-44/CD细胞呈阳性表达,检测到大量的凋亡信号；未转染的细胞基本无凋亡表现.透射电镜观察细胞超微结构发现：5-FC10 μmol/L和100 μmol/L作用SHG-44/CD细胞72h时,细胞体积缩小,胞膜皱缩、起泡、发芽,染色质浓缩并凝集成块,出现致密的染色质沿核膜内侧排列的核边集现象等特征性凋亡形态改变.100 μmol/L时有少部分细胞出现坏死,分析可能为凋亡后期的细胞.因一些凋亡诱导剂作用于细胞时,开始细胞以凋亡为特征,但随着诱导时间的延长,或诱导剂浓度的增加,凋亡后期的细胞也会发生继发性坏死的改变,称细胞凋亡性坏死,或继发性坏死（secondary necrisis）［12］.流式细胞检测术定量检测,结果显示,5-FC处理72h后,SHG-44/CD细胞出现较高的细胞凋亡率,最高达18.6%,与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）.流式细胞仪分析观察到SHG-44/CD细胞的凋亡显示剂量依赖性.国外学者的研究结果［13~15］显示5-FC对C6、U87、Gli36Δ5等胶质瘤细胞也有明显的凋亡诱导作用,并且同样存在剂量-效应依赖性,但流式细胞仪所测得的细胞凋亡率有所不同,原因可能与实验所用的细胞对5-FC的敏感性有关.而目前国内外文献未见CD/5-FC自杀基因治疗系统对SHG-44胶质瘤细胞凋亡作用的研究报道.

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