[提要]   由Osrliny于1984年首斜的单细胞凝胶 电泳(SCGE)用于检测DNA 单或艘链缺口,具有简单、灵敏、迅速且不露最射性植毒标记等优点.其基末原理是将单细胞包埋于琼脂糖凝脏中进行裂解、电泳、蔓光染色和显鞋镜鞋州． 细胞DNA 搦伤_盘生的链龌口在电泳中迁牡丹{成典型的 彗星” 圈像(垃又称Comet Assay) 根据迁移长症和趋光强度即可定量分折I)NA损伤,垃诚方击在旋射生物学、遗传毒理学 群体生物学监洲、肿瘤发稿机制、肿瘤治疗学瞄疆蛔他凋亡等领域具有厂泛应用.

一、简介
    单细胞凝胶 电泳(single cell gel elee—trophoresis,SCGE) 卫称Comet Assay,是Ostling和Janhanson“ 于l984年发明的一种单细胞DNA 电诛技术,其后由Singh 和0一live 分别加以改进,使之成为一项目臻完善的定量检测DNA双或单链躲口的技术.较之传统检测手段,诸如碱性解链、碱性蔗糖沉降试验,碱洗脱等方法,SCGE具有更敏感、简便、迅速、样本需量少,不需放射性标记等优点.从理论上讲凡是可切除而转变为链缺口的DNA损伤,均可用该方法进行检测,因而,SCGE在放射生物学、遗传毒理学、群体生物学监测、肿瘤发病机制及治疗学以及细胞 亡等领域具有重要的研究和应用前景.与此同时,SCGE方法本身也进行了更为深八的研究

二、原理
    传统DNA 电泳理论认为,DNA迁移距离是与其片段太枣成比蜘的,与此相反,SCGE昕形成的“彗星”形态并非由断裂的DNA小片段迁移而形成 SCGE有着与传统的电泳不同的形成机理.在细胞核中,DNA是环状附着在棱基质上,在细胞裂解过程中,核基质被溶解、抽提,DNA则仍保留一核样结构.如果DNA链上存在缺口,则使DNA超螺旋变得松驰 ,DNA环将向外伸展,同时由于缺口暴露了阴电荷,在电场力作用下,松动的DNA环将向阳极迁移 但这种松动的DNA环其一端仍附着于核DNA,其迁移距离受到限制 因此,迁移的远近(尾长)与松动释放的DNA环量多少.
并不完垒一致 故尾长并不总是真实反映链缺LI的多少,事宴上,反映DNA损伤程度的因素还包括尾部DNA的含量.簖言之,舍DNA链缺口越多,则进入尾部的DNA越多,表现为尾长和尾部荧光强度的增加.未损伤细胞在电泳中DNA停留于棱中形成圆形的荧光团,而损伤的细胞除了核DNA光团(彗星头)外,还有迁移的DNA形成的彗星尾,从而形成了SCGE特有的电泳形态.

三、实验方法
    自从Singh和0live对最初的中性裂解方法加以改进后, 目前形成两大类即中性和碱性SCGE 很多研究者为了不同的目的在具体步骤上作了多种改进,但基本原理相同.改变实验条件的好处是可达到不同的实验目的,缺点是在不同实验间难以进行对比分析.故十分强调设置对照.下面介绍实验过程(碱性方法).
1．细胞来源
    从理论上讲,一切活的真核细胞均可进行该项实验 细咆可来自培养的细胞系或从活体组织分离的细胞 细胞悬于PBS (不含ca ．Mg 7),细胞数(1～5)×106／ml.细胞包埋于
凝胶的浓度各家报道不一,一般每张玻片需包埋10 000~100 000个细胞,这一范围可提供满意的细胞密度.操作过程中应避免不必要的DNA损伤及修复.Singh“ 认为胰蛋白酶消化和搔刮均可导致DNA损伤,故建议在载玻片上进行单层细胞培养,然后原位诱导损伤和进行SCGE.
2．细胞处理
    细胞在电泳前一般先作DNA损伤的诱导处理,处理剂最常用放射线、氧化剂、紫外线和基因毒药物.其中,放射线和氧化剂及部分基因毒药物可直接形成DNA链缺口,而紫外线损伤需在细胞DNA切割修复系统参与下形成缺口.基于这一原理,SCGE又用于研究DNA损伤的修复.DNA损伤的诱导处理可在体外或直接在活体进行,处理后细胞既可立即作SCGE,也可再孵育不同时间以作损伤修复研究 一般认为,正常细胞DNA缺口修复可在3O分钟内完成,而切割修复过程稍慢,历时约4小时.活体处理则是直接对活体全身或局部进行照射或用药,在一定时限内取活体组织分离细胞进行实验.
3．电泳
    制胶 在毛玻璃载玻片上滴加1.0 10．S 正常溶点琼指糖凝胶(溶于不含Ca 、Mg”的PBB),加盖盖玻片.该层目的是加强胶板对玻片的附着.胶凝固后揭去盖玻片,滴加第二层75m 含细胞的低溶点琼脂糖(终浓度
    0．5 ～1 ,含细胞数10 o0O～100 000),盖上盖玻片,待其凝固后再照上法滴加第三层100~1不含细胞的低溶点琼脂糖.裂解去掉盖玻片,将凝胶玻片浸入新鲜配制的玲裂解液中(含2．SM NaCl、100raMNa 2一EDTA、10raM Tris,pH10,用前加入1TritonX一100和10 = 甲亚砜),一般裂解时间不少于1小时.电泳裂解后玻片置于水平电泳槽内,电泳缓冲液(O．3M NaOH、lmM EDTA)盖过胶面约2．Smm,静置2O分钟解链 之后接通电源,电泳条件2SV (0．54 SV／cm),300mA,时间20分钟.电泳完毕后以0．4M Tris(pH7．5)洗涤三次,每次5分钟.染色可选用多种荧光染料.最常用溴化乙啶,用量50～lO (4ug／m1),滴至胶板上然后盖上盖玻片,24小时内检测.时间过长将导致荧光褪色.上述过程均应在黄或红光下操作, 以避免再引起DNA的损伤.
4．电泳图像分析
    染色后即可在荧光显微镜下观测.图像一般放大200倍,亦有放大400倍以上者,然后进行图像分析、拍照和摄像,或利用数字化技术,用与电脑相连的CCD像机,直接将图像信息输入电脑,再用相应的图像分析软件进行分析 目前国外已有多种Comet分析软件出售,售价在数千美元,价格昂贵,国内急待开发类似软件.由于“彗星 成像是因损伤DNA在电泳中从核内迁出,故“彗星”尾长、密度等是评价和量化电泳结果的重要因素.最为简单的方法是根据DNA损伤程度来主观分级评分.如分为五级：无损伤(DNA损伤<S )；低损伤(j～ 2O )；中度损伤(20 ～4O )；高度损伤
    (40 ～95 )i完全损伤(>9S ) .判断标准完全凭经验,虽缺乏精确性,但具有实用价值,至今仍被延用.另二个重要和常用的参数是尾长和尾素.尾长(tail lenth)与损伤DNA迁移直接相关的,在低损伤剂量范围内尾长与损伤呈线性关系,但当损伤剂量超过某一范围时,尾长并不随损伤的增加而增长,此时,尾部DNA密度(荧光强度)与损伤程度的关系更为密切.Olive 提出尾素(tail moment)的概念,即尾部DNA百分含量与尾部距离的乘积 实验证明,在高剂量损伤下,尾素与损伤程度仍保持较好的线性关系,故该参数能较满意地用于多种情况下的SCGE分析 但困其需电脑计算,限制了其在国内的应用.Monteith. 评价了多种参数,并建议用迁移距离(migration lenth)>7O m (约为平均细胞核直径的二倍)的细胞百分数作为评价参数,认为该参数简便且重复性好.


四、应用
1．DNA损伤与修复
    放射线、氧化剂以及紫外线是自然界最常见的DNA损伤因子.射线和氧化剂直接诱导DNA链缺口, 紫外线则产生DNA加合物(bulky adduets),在细胞切割修复系统参与下锄生DNA链缺口,这些缺口增加DNA的不稳定性,可导致基因突变和染色体畸变 SCGE刚可对其进行快速、敏感的定量检测维普资讯 http://www.cqvip.com通过控制射线剂量和选用不同射线诱导损伤,是放射生物学常用的研究手段,DNA链缺口的形成,直接反映这种损伤的强弱.同时损伤修复的差异亦可通过SCGE进行检测,从而为DNA损伤修复研究创造了条件.SCGE不仅能提供敏感精细的定量分析,还可提供单个细胞反应的异质性信息.
一 在肿瘤的放、化疗中,由于肿瘤细胞群的高度异质性．其对治疗耐受的亚群增殖往往使治疗归于失败.SCGE可对肿瘤细胞亚群的治疗反应进行评价.Slim 用SCGE体外检测一种可选择性作用于厌氧(hypoxia)肿瘤细胞的药物Tirapazamine对人和鼠的多个肿瘤细胞系DNA的损伤,观察到其诱导DNA损伤的作用与其细胞毒作用一致,显示SCGE对治疗的预测价值.由于SCGE所需细胞数少,穿刺活检标本已足够应用,故临床应用价值较高.目前已知活性氧根具有多种基因毒作用,如DNA链缺口、诱导畸变等.内源性自由基对DNA的损伤最终可致癌发生.现有的资料已充分证明了活性氧根在疾病过程中的重要作用.因而氧化剂也被广泛用于基因毒实验中.Collins“”等将裂解后的细胞与内切酶共同孵育后作SCGE研究氧化损伤的修复过程,Ander—SOn” 则对外源性抗氧化剂的保护作用进行了探讨.在SCGE中发现的由紫外线诱导的缺口实际是DNA修复过程中切割与再连接之间的平衡.某些切割修复缺陷者如脱色性干皮病(xP)其淋巴细胞在紫外线照射后的SCGE图谱中无“彗星”尾形成. ,显示了SCGE的诊断价值,并可推知是修复过程中的切割缺陷所至 相反,如果形成过量缺口,则问题可能出在再连接过程中.
2．遗传毒理学
    DNA损伤的诱变和致癌效应是遗传毒理学研究的重要内容.SCGE不仅能提供DNA损伤信息,也可提供环境物质改变修复过程的信息.运用SCGE在活体进行遗传莓理学研究,还可了解药物遗传毒作用在不同组织和细胞中的分布.Pool—Zobel“ ” 通过口服或吸入亚硝胺研究药物的动物器官特异性作用,认为器官特异性基因毒是与器官特异性癌症密切相关的.
3 群体生物学监测
    SCGE已被用于人群淋巴细胞对多种环境固素和化学物质致DNA损伤的敏感性筛选.Leroy“ 比较了碱洗脱 缺口位移和SCGE,认为后者更敏感、简便,耗时短,可检测大样本,故是群体生物学监测较理想的方法.
4、细胞凋亡研究
   细胞ij{4亡是细胞增殖、分化和死亡过程的重要讶节机制.该机制紊乱与肿瘤发生密切相关.删亡细胞在核碎裂早期即有大量DNA链缺口,在SCGE中大量DNA进入尾部,且迁移距离延长．甚至与“头部”分离,形成不同于一般损伤的特有形态.其尾素值常高于3O或60“ (正常<2．0).Olive“”结合DNA交联剂mechlorethamine用scGE检测细胞凋亡,由于交联剂可抑制DNA迁移,凋亡细胞较之非凋亡细胞需数倍以上交联剂处理才获得相似的迁移抑制.由于SCGE的高度敏感性和直接观测单个细胞DNA片段迁移,可以预见该技术在细胞7周亡检测中日益重要的地位.

五、展望
   尽管SCGE的确切机制仍不清楚,但该技术的广泛应用前景毋容置疑,方法学本身的拓展亦呈现诱人的前景,如采用辅助手段将DNA损伤转变为链缺口进行检测；结合免疫学方法进行亚细胞群体研究.与此同时,SCGE仍存在诸多尚待改进的缺点,如不同实验条件特别是电泳条件对电泳形态的影响：对不同类型细胞实验结果的不一致性,以及凝胶制作过程中胶板易损等问题.相信随着认识的深入,这些问题终将解决.

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