甲状腺相关眼病(Thyroid?associated ophthalmopathy,TAO)动物模型的建立,尚在努力中,因而,体外培养TAO患者的眼眶成纤维细胞(orbital fibroblast,OF)成为一种常用实验模式.OF作为眶内自身免疫反应的靶细胞和效应细胞,在TAO的发病过程中起着重要作用.1987年Bahn等[1]就在体外成功的培养了OF,我们结合郑健墚[2]的方法培养TAO患者和正常对照者的OF,并进行比较和鉴定.

    1材料和方法

    1.1材料  球后脂肪结缔组织标本来源于2007? 01/2007? 03核工业416医院眼科行甲状腺相关眼病矫正术（深层眶脂肪切除术）的严重TAO患者4例4眼,男1例,女3例;右眼2例,左眼2例.年龄39～56(平均44.5)岁;病程15～48(平均27.5)mo.患者符合TAO的诊断标准[3]且有手术指征[4],并排除其他自身免疫性疾病.手术前均使用过糖皮质激素60mg×7d及钴?60放射治疗20Gy/10d,但效果欠佳.均因严重的暴露性角膜炎﹑进行性视力减退及无法接受的眼外观而要求行手术治疗.正常对照组来源于2例角膜穿通伤并要求义眼植入患者的眼球摘除术中,年龄33和40岁,男女各1例,均排除了其它免疫性和炎症性疾病.主要试剂有:DMEM高糖培养基（海克隆生物化学制品有限公司）,胎牛血清（中美合资甘肃兰州民海生物工程有限公司）,胰蛋白酶（SIGMA公司）,小鼠抗人Vimentin mA6,小鼠抗人S?100 mA6,小鼠抗人CK(cytokine,CK) mA6(SANTA公司,USA).培养液配制:取高糖DMEM培养基80mL,加入胎牛血清20mL,配成含胎牛血清培养液,于4℃保存备用.混合消化液配制:取PBS液100mL,加入胰蛋白酶0.25g,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,分装后4℃保存.手术台上取下的眼眶脂肪结缔组织标本放于含青霉素100KU/L和链霉素100KU/L的DMEM液中,以4℃冰壶2h内运至实验室开始实验.

    1.2方法  采用组织块培养法.取材后放入培养皿中,于显微镜下尽量剔除脂肪组织和较大的血管,保留结缔组织,用PBS液将组织块反复冲洗3次,再用眼科剪将其剪

    图1  培养的眼眶成纤维细胞的形态  A:接种5～7d正常人；B:接种5～7d TAO患者；C：接种9d正常人；D:接种第9d TAO患者；E：正常人OF细胞融合；F:TAO患者OF细胞融合

    成1mm3左右的小组织块.用弯头吸管将剪好的小块按5mm间距,均匀的摆置于瓶底,然后将培养瓶轻轻翻转,瓶底向上,向瓶内注入培养液3mL,盖好瓶盖,放入37℃, CO2孵箱内静置.5～8h后,待组织小块稍干并紧贴瓶底时,轻轻将培养瓶翻转平放,静置培养.此后每3d部分换液1次至细胞长出,并同时去除漂浮组织块和残留的红细胞.5～7d时可见细胞从组织块周围爬出,此后每2d部分换液1次,并及时观察和记录培养液pH值﹑细胞形态及贴壁﹑伸展﹑增殖状态,2wk后细胞铺满80%瓶底,基本融合,及时传代.2wk后,细胞首次传代.充分吸出瓶内旧培养液,加入混合消化液2mL,消化4～6min.将培养瓶放置于倒置相差显微镜下观察,见细胞开始回缩,呈单个圆形,细胞间隙增大,即加入含胎牛血清的培养液2mL终止消化.用吸管吹打瓶壁,使细胞悬起成细胞悬液,将其吸入离心管,于离心机中以1000r/min离心5min,吸出上清液,加新的培养液到离心管内,吹打形成细胞悬液,并按1∶2传代后种入新的培养瓶,置于37℃,CO2孵箱内,每2d更换1次培养液,3～5d即可再次传代.倒置相差显微镜下观察OF的生长状况及细胞形态,并做显微照相记录.传代后,以104/孔接种于6孔板,每天取3孔TAO患者及正常人的OF,消化为等体积细胞悬液,以血球计数板进行计数,计算均值,绘制出生长曲线.

    1.2.1细胞形态学观察[5]  取对数生长期细胞,接种于预置盖玻片的6孔板中,当细胞长成单层时,及时取出盖玻片,用PBS洗涤3次,风干；丙酮原位固定10min；PBS洗1min/次,共2次；浸入苏木精染液,染色5～10min；自来水浸洗；浸入稀盐酸乙醇溶液进行分色数秒；自来水浸洗；浸入淡氨水中,使胞核蓝化,3～5min；自来水浸洗；浸入伊红染液,染色5～10min；自来水浸洗；经乙醇逐级脱水,1min/次；二甲苯透明3次,1min/次；在载玻片上滴加中性树胶,将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻片上；置光学显微镜下观察,照相,记录.

    图2  眼眶成纤维细胞生长曲线



    1.2.2免疫组织化学鉴定  取对数生长期细胞,接种于预置盖玻片的6孔板中,待细胞长成单层后,取出,用PBS冲洗,5min/次,共3次,风干；甲醛固定30min, PBS冲洗5min,风干,滴加正常牛血清,37℃保温15min,弃去正常牛血清；分别滴加小鼠抗人Vimentin mAb、小鼠抗人CK mAb,小鼠抗人S?100 mAb, 小鼠抗人Desmin mAb 4℃过夜孵育；PBS冲洗3min,共3次,滴加生物素标记羊抗小鼠IgG, 37℃保温20min；PBS冲洗3min,共3次,滴加SP复合物,37℃保温20min；PBS冲洗3min,共3次,DAB显色剂显色,THB洗1次,浸入底物溶液,暗置10min；自来水洗5min,细胞核衬染,逐级脱水,透明,封片.

2结果

    2.1眼眶成纤维细胞生长过程  TAO患者与正常对照的OF在体外均较易生长,细胞形态区别不明显.在接种5～7d后,可见组织块周围有少量细胞游出(图1A,B),呈细长梭形,胞体两端长突起,有的可相互连接成网状.7～9d后细胞大量游出,呈典型的梭形,胞体较丰满 (图1C,D).正常人与TAO患者的OF,换液后生长较快,约2wk左右细胞均达到融合,此时可见细胞密集成片,难分彼此,相互重叠,可进行首次传代（图1E,F）.传代后细胞生长较快,3～5d就可再次传代,反复换液和传代,即可得到纯化的细胞,且生物学性状相对稳定(图2).

    图3  OF（HE×100）  A：正常人；B：TAO患者

    图4  OF（SABC×100）  A：正常人；B：TAO患者

    2.2眼眶成纤维细胞的染色和鉴定  HE染色可见正常人与TAO患者的眼眶成纤维细胞呈两头长突起的梭形,胞质丰富、色浅红,胞核呈椭圆形、色浅蓝,位于细胞中央,核仁不明显(图3A,B).细胞Vimentin染色均呈阳性,阳性棕色反应产物均匀分布于胞质中(图4A,B).而Desmin,S?100,CK染色阴性,鉴定为成纤维细胞.

    3讨论
    为了深入研究TAO,建立符合实验要求的动物模型,Many等[6]利用基因免疫的方法于1999年在哺乳动物Balb/c鼠活体内建立了甲状腺相关眼病动物模型,其特征包括：有甲状腺疾病,眼眶组织的眼外肌增粗,球后组织水肿,眶内有严重的脂肪堆积和淋巴细胞浸润.国内目前该领域的研究工作也正在开展,这为我们深入研究TAO开创了新的途径,但体外细胞培养的实验模式在临床疾病的机制和药物研究方面也有不可替代的作用,特别是近年来在中药药效学及有效成分筛选等方面不失为一种经济有效的方法[7].目前眼眶成纤维细胞的培养技术已较为成熟,在培养过程中,可观察到体外培养的OF属贴壁型细胞,培养成功的关键在于接种的组织块是否能牢固的贴壁,因此,接种组织块后,等待翻转培养瓶的时间及初次所加培养液的量尤为值得注意[8].各类书籍和文献的报道差别较大,在实验过程中,经过反复比较,5～8h后翻转培养瓶,以3mL的培养液初次培养,可减少组织块的损耗量,组织块基本能紧贴瓶底而不浮起.

    眼眶成纤维细胞的体外培养是成功的,实验中我们观察到,TAO患者与正常人OF在体外培养均较易生长,细胞游出与传代的时间基本一致,相差显微镜下可观察到细胞形态,且二者无明显差异,免疫组织化学鉴定方法显示,OF表达Vimentin但不表达CK,与上皮细胞区别;不表达S?100,与黑色素细胞相区别;不表达Desmin,与肌细胞相区别,说明细胞为间叶来源,证实为成纤维细胞,为下一步试验打下了基础.

    【参考文献】
    1 Bahn RS, Gorman CA, Woloschak GE, et al. Human retroocular fibroblasts in vitro: a model for the study of Graves\' ophthalmopathy. J Clin Endocrinol Metab 1987;65(4):665?670
    2郑健墚，郭彦，张洁，等.人眼Tenon氏囊成纤维细胞的体外培养.解剖学研究1999;12;21（2）:96?97
    3惠延年.眼科学.北京：人民卫生出版社2001:194?195
    4肖利华，宋国祥.眼眶手术学及图解.郑州：河南科学技术出版社1999:219?220
    5司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安：世界图书出版公司2004：264?266
    6 Many MC, Costagliola S, Detrait M, et al. Development of an animal model of autoimmune thyroid eye disease. J Immunol 1999;162(8):4966?4974
    7李蓓，郑燕林，江文，等.眼眶成纤维细胞与甲状腺相关眼病.国际眼科杂志2008;8(5):1008?1011
    8董凯，何为民，罗清礼.甲状腺相关眼病组织病理学研究.国际眼科杂志2008;8(6):1159?1161