一 、用异硫氰酸胍提取
    提病毒的详细步骤,可参考（我提过 N 次做定量 PCR 都没问题）：
    1 、取 200ul 样品数 + 阴性对照 + 阳性对照个 1.5ml 灭菌 eppendorf 管
    2 、加 600ul 异硫氰酸胍,然后加入对照和样品,再加 200ul 氯仿,颠倒混匀
    3 、 13000rpm 离心 15min
    4 、在第 3 步离心快结束时,另取同样多 eppendorf 管,加入 400ul -20 度预冷的异丙醇
    5 、取第 3 步离心的上清（一定不要吸取到中间白色层,第 3 步离心结束往外拿的时候,管子尽量不要倾斜）转移到第 4 步准备的管中,颠倒混匀
    6 、 13000rpm 离心 15min ,轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体
    7 、加 600ul 75 ％乙醇,颠倒数次以洗涤残存异丙醇
    8 、 13000rpm 离心 15min ,轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体
    4000rpm 离心 10sec ,将管壁残存液体甩到底部,用微量枪头吸干,室温干燥 2 － 3min （不可过分干燥,防止下一步 RNA 不溶解）
    9 、加入 20ul DEPE 水 ( 加入 depc 的纯水高压后的水即为 DEPE 水 ) ,轻轻混匀溶解 RNA . 2000rpm 离心 5sec ,冰上保存备用（最好 2 小时内使用,以免 RNA 降解）

二、用 TRIzol LS 提取
    应用 TRIzol LS 提取病毒 RNA 所提取物为血清、血液、液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒.提取时尽量在人少时进行,防止空气中 RNA 酶的污染.所用一切物品也应是无 RNA 酶的.
    2.1 在 1.5ml 的 eppendorf 管中加入病毒原液 500ul ,再加入 TRIzol LS 500ul ,充分混匀,室温放置 10min .
    2.2 加入 200ul 的氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡离心管（溶液充分乳化,成乳白状,无分相现象）,室温放置 10min （由于氯仿沸点低、易挥发,振荡时离心管可能爆开,小心）.
    2.3 离心 4 ℃ 、 13000r/min 、 15min ,取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）.
    2.4 加入等体积异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,室温放置 10min .
    2.5 离心 4 ℃ 、 13000r/min 、 15min ,（这时乍一看会发现管子里好像没有东西,再仔细看看,会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物,就是它了）用枪小心吸去所有上清.
    2.6 1ml75% 乙醇洗一遍,离心 4 ℃ 、 8000r/min 、 10min ,（这时又会发现管子没东西了,不要担心,有的,但是因为量太少看不见罢了）用枪小心吸去所有上清,在超净台中干燥 5min .
    2.7 加入适量 DEPC 处理水.（如果材料来源丰富的话,加入的水量为下一步 RT 的 total 减去其他试剂的量；若要省着点用,则自己看着办了,尽量不要加太多的水）.
    2.8 建议立即做 RT .若要保存,可在上一步加入乙醇后冻存于－ 70 ℃ ,可保存一年；若加入 DEPC 水后则只能在－ 20 ℃ 保存 1 个月左右.

三、 Trizol 法提病毒 protocol
    Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克.
    1 、取鸡胚尿囊液,加入 5-10 倍体积 Trizol 液,混匀；
    2 、室温放置 5 分钟,然后以每 1ml Trizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管 15 秒；
    3 、取上层水相于一新的离心管,按每 ml Trizol 液加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置 10 分钟, 12000g 离心 10 分钟；
    4 、弃去上清液,按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75% 乙醇,混匀, 4 ℃ 下 7500g 离心 5 分钟；
    5 、重复第 4 步；
    6 、小心弃去上清液,然后室温干燥 5-10 分钟,注意不要干燥过分,否则会降低 RNA 的溶解度；
    7 、然后将 RNA 溶于水中,放置 10 分钟.

[ 注意 ]
1 、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作.
2 、加氯仿前的匀浆液可在 -70 ℃ 保存一个月以上, RNA 沉淀在 70% 乙醇中可在 4 ℃ 保存一周, -20 ℃ 保存一年.

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