实验原理：
    Southern Blot是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法.一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量

基本方法及主要步骤：
Southern印迹杂交的基本方法包括四部分,以下以植物southern印迹杂交为例.
　　（1）植物基因组DNA提取；
　　（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；
　　（3）探针的标记和纯化；
　　（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针.

主要操作步骤：
　　1．琼脂糖电泳
　　（1）取一定量的待测DNA样品,用适当的限制性内切酶酶切.DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异,对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析,取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列,则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时,则需要30～50μg.
　　（2）酶切完毕,在琼脂糖凝胶中电泳.
　　（3）电泳结束后,EB染色,长波紫外线下观察电泳结果及照相.
　　2．印迹转移
　　（1）切胶并作标记（左下角切除）,以便于定位,然后将凝胶置于一容器中.
　　Southern印迹杂交转膜示意图（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中,室温下放置1h 使之变性,不间断地轻轻摇动.
　　（3）将凝胶用去离子水漂洗1次,然后浸泡于适量的中和液中30 min,不间断地轻轻摇动.更换中和液,继续浸泡15 min.
　　（4）将滤纸,硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小,NC膜浸入转移buffer中平衡30 min.
　　（5）按右图操作：逐层铺平,各层之间勿留有气泡和皱折.
　　（6）虹吸转移12-16h.
　　3．固定DNA
　　（1）取出转移后的NC膜,用滤纸吸干NC膜,NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min.
　　（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上,中和两遍,每遍5min.
　　（3）将膜夹在两张干燥滤纸间,80℃烘烤1-2h.
　　4．预杂交
　　（1）将膜浸入5×SSC 中2min,将膜放入干净的塑料袋中.
　　（2）将预杂交液事先在65℃ 预热,然后将10 ml 预杂交液加入袋中,封口.
　　（3）65℃预杂交1h 以上,不时摇动.
　　5．杂交
　　（1）取出杂交袋,剪去一角去除杂交液后,加入5ml杂交液及5μl 变性探针,排除气泡后封口.
　　（2）将杂交袋放入65℃ 水中杂交过夜.
　　6．按下列条件洗膜
　　2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温 5min /2次
　　0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2次
　　7．免疫酶联检测
　　（1）偶联反应
　　①用中和液 洗膜2min,室温.
　　②用封闭液50ml洗膜30min,室温,轻摇.
　　③用中和液将稀释抗体-Dig –Ap 至750 mU/ml ,将膜封入杂交袋,加入5 ml稀释抗体轻摇50min.
　　④用中和液 50 ml洗膜,10min ×2次,室温,轻摇,除去未结合的抗体.
　　（2）显色反应
　　①用平衡液20 ml平衡膜2min.
　　②将膜装入杂交袋中,加入5ml显色液,避光30min 左右,当出现颜色时不要晃动.
　　③用TE洗膜终止反应.
　　④80℃烤干.

主要应用
　　1.遗传病诊断
　　2.DNA图谱分析
　　3.PCR产物分析

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