一、逆转录病毒概述
    反转录病毒是RNA病毒,但有反转录酶,可使RNA转录为DNA,再整合到宿主细胞基因组.　　逆转录病毒即RNA病毒,需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒.逆转录病毒是RNA病毒,它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白.

二、逆转录病毒的许多特点
便于其发展成为动物基因克隆载体.①就目前所知,在大多数情况下,逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene,ONC）都能够在细胞中转录.这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子,同时根据这种特性,可以在正常细胞中进行操作,将它改建为有用的动物基因转移载体.②逆转录病毒的寄主范围相当广泛,包括无脊椎动物,其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高,而且通常不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代,保持正常生长和保持病毒感染性的能力.

逆转录病毒载体最大优点是
    (1) 转染范围广,可以感染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; 
    (2) 转入的外源基因可完全整合
    (3) 对细胞感染率高,达到100 %
    (4) 感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因

三、 逆转录病毒载体的包装原理
    逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身.在逆转录病毒载体中,去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号,通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上,而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白.当重组病毒载体导入包装细胞后,缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞,此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中,导致插入序列在宿主细胞中表达,产生目的蛋白.宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白,因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题.

四、逆转录病毒包装程序
    1、接种293细胞
    2、磷酸钙转染：编码逆转录病毒载体、逆转录病毒结构基因质粒（是病毒颗粒形成、复制所必需的病毒结构蛋白基因）共导入293细胞

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    磷酸钙转染原理：磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙／DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法.磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合.磷酸钙／DNA复合物黏附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞,被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达,也可整合到靶细胞的染色体上,从而产生不同基因型和表型的稳定克隆.该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞.
    3、接种靶细胞
    4、收病毒上清感染靶细胞/保存

【方法与步骤】 
（一）将逆转录病毒载体导入293细胞
    1．在转染前24 h,在铺有4ml的293生长培养基的60mm培养皿中接种包装细胞293细胞,接种密度大约2.5x10⁶. 
    2．转染前移去培养基,并加入新鲜的培养基. 
    3．在双蒸水中加入6～10μg质粒DNA,形成鸡尾酒感染混合液,终体积为438μl.再加入62μl的2mol/L CaCl₂溶液. 
    4．加入500μl的2 ×HBS(pH7.05),晃动管子或用移液管吹打均匀,立即将溶液加到细胞上,并轻旋平皿使混合均匀.然后,将细胞放回培养箱中培养. 
    5．转染36 h后,移去培养基,并温和地加入3ml新鲜的293培养基. 
    6．大约在转染48 h后,收获逆转录病毒上清.轻轻地移出上清,用0.45μm的滤膜过滤,或在4℃以500g离心5min以除去活细胞. 
    7．如果在1～2 h内使用逆转录病毒上清,将其放置在冰上.若时间间隔较长时,置于干冰上冰冻,而后转到-70℃贮存. 
    8．融化冰冻的上清,在37℃下加温片刻,立即使用. 

（二）用逆转录病毒上清感染NIH-3T3细胞 
    1．在感染前12～18h,将5x10⁵的NIH-3T3细胞铺于100mm的平皿中. 
    2．准备3ml的包含逆转录病毒上清、4μg/ml的polybrene,和成纤维细胞培养基的感染混合剂. 
    3．从铺有NIH-3T3细胞的平皿上移去培养基,并加上感染混合剂. 
    4．将平皿放回培养箱中培养至少3 h. 
    5．向平皿上加入7ml成纤维细胞培养基. 
    6．转导细胞在感染后36～48 h可以进行检测.

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