1  实验原理

酵母双杂合系统是在1989年由Stanley Fields和Ok-kyu Song等提出并初步建立的，该系统是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。近几年来随着人们对该系统的广泛应用，这一系统得到了不断的完善及改进。这一技术在不同研究领域中的广泛应用有力地推动了蛋白质与DNA、蛋白质与RNA、以及多种蛋白质分子间相互作用的研究。

                              图1  酵母双杂交的原理

酵母双杂交系统的原理如图1所示。典型的真核生长转录因子如GAL4、GCN等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同的两个结构域可以重建，发挥转录激活作用。激活作用可以通过报道基因的表达来探测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

在酵母双杂交系统中，主要包含两类载体，即含DNA 结合结构域（BD）的载体和含DNA激活结构域（AD）的载体。这两类载体在构建融合基因时，待测蛋白基因及诱饵蛋白基因必须分别与两个结构域的基因在阅读框内融合。融合基因在酵母细胞报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-BD载体具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-AD载体没有。因此，在GAL4-AD氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用BD结构域基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-BD编码序列。常用的AD结构域基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

酵母双杂交系统的另一个重要组成部分是报告株。报告株是指经改造的、含报告基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，它具有许多优点: 〈1〉 易于转化，便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-BD， LexA-BD)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-AD， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白质之间的作用使得转录因子重建导致相邻的报告基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白质之间的相互作用。

2 试剂与设备 

2.1. 用品和仪器：

10cm平板，15cm平板，涂布棒，高速离心机，接种环 摇床，恒温培养箱，试管，水浴锅，15mL 离心管，100mL 离心管，无菌工作台 

表1 各种培养基的配方

注：(1) 5×缺陷型培养基母液为单独配制，即：50× Leu,50× His,50× Trp,50× Ade;

    (2) 以上所有试剂配好后均要高压灭菌；

   1）YAPD培养基（配法见表26.1）

2）SD培养基  （配法见表26.1）

3）LB培养基  （配方见表26.1）

3) 1× TE/LiAc：1mL  10℃TE  1mL  10×LiAc  8mL 双蒸水

4) 1× TE/LiAc/PEG: 1mL  10×TE  1mL  10×LiAc   8mL  50% PEG

5) 50% PEG:取5mL  PEG加入等体积的无菌水，加热至50℃使其充分互溶；

6）10×TE Buffer：0.1M Tris-HCL,10Mm EDTA ,pH= 7.5

7) Z Buffer:Na2HPO4.7H2O=16.1g/L;aH2PO4.H2O=5.50g/L;KCL=0.75g/L;

MgSO4.7H2O=0.246g/L，pH=7.0

 8）X—gal显色液：1mL  Z Buffer,2.7μl β-巯基乙醇

 9）酵母裂解液I：100 Mm Trizma, 20 μM β-巯基乙醇,pH=9.3

  10) 酵母裂解液II: 1 M山梨醇，1M醋酸，1%纤维素酶，20 μM β-巯基乙醇,pH=5.5

  11）细菌裂解液I：溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl（pH=8.0），10mmol/L EDTA）

  12）细菌裂解液II: 0.2mol/L NaOH，1% SDS

  13) 细菌裂解液III: 147.2g KAc，57.5mL 冰醋酸，加水至500mL 

14) 其它：，3-AT，氨基酸，AH109酵母，鱼鲑精DNA,100%DMSO

3  实验方法 

3.1诱饵蛋白的PCR扩增及克隆

以cDNA文库为模板对诱饵蛋白基因的开放阅读框序列进行PCR扩增，在0.2ml PCR反应管中依次加入超纯水

16.2μl、10×buffer2.5μl、dNTP2.5μl、Primer 1 和Primer 2 引物各1.3μl、模板1μl、高保真DNA聚合酶0.2μl，总体积25μl。混匀器上混匀，4℃瞬时离心，在PCR仪上进行反应，设置反应条件为: 94℃ 4 min一个循环，(94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min) 30个循环，72℃8 min一个循环，反应结束后，取5μl上样于1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

将含有目的片断的PCR产物收集起来进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察目的片断分离即可切胶。参见上海生工凝胶回收试剂盒说明，将切割下的含目的片段的凝胶称重，于l.5ml离心管中每100微克加300ul的banding buffer，在50℃以上加热溶解，每隔两分钟在混匀器上混匀一次，10min以后将溶解DNA的banding buffer转入纯化柱子于4℃，8000 rmp离心1min:加入500ul的washing solution,室温放置2 min于4℃，8000 rmp离心1min，重复washing solution步骤一次。然后将纯化柱子再离心一次（4℃，8000rmp离心1min）。加超纯水30μl于纯化柱子中，室温放置2 min，然后将纯化柱子放在一个干净的l.5ml离心管中，于4℃，12000 rmp离心1min，所得产物-20℃保存。

应用连接酶将纯化后的PCR产物与pMD18-T 载体进行连接，连接试剂为pMD18-T 载体1μl，纯化的DNA片段4μl，连接酶5μl，连接条件是在16℃连接过夜。

取连接反应产物10μl，加入DH5α感受态宿主菌80μl，轻轻混匀后冰浴0.5h; 42℃热休克60s~90s，冰上放置5min，加入1000μl LB培养液，37℃轻轻振摇l h，3000r/min离心2min，弃上清液留200μl沉淀菌混匀后，均匀涂布于含Amp的LB平板上进行筛选，37℃培养过夜。  

挑选形态较好数个菌落，接种于5ml LB培养基中(含Amp 100ng/μl)，37℃摇床200转/min震荡培养过夜，随机挑选7个克隆，经PCR初步鉴定后，碱裂解法提取质粒，EcoRI酶切鉴定，对鉴定正确的克隆，重新摇菌、提质粒，由上海英俊公司进行测序。 

质粒提取过程如下：细菌培养：从琼脂平板上挑取单菌落接入5ml含适合抗生素的LB培养基中，于37℃摇床中振荡培养过夜。第二天早晨保种：取80%灭菌甘油300ul加入1ml菌种中冷冻保存。然后提取质粒 ：

（1）1.5ml过夜培养物倒入EP管，5000rpm/10min，弃上清；