1、PCR产物的电泳检测时间
    一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失.
2、假阴性,不出现扩增条带
    PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究.
    模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚.⑤模 板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改.
    酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.
    引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因.有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单 位.②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度.③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效.④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等.
    Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.
    反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败.
    物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准的温度计,检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一.
    靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的.
3、假阳性
   出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高.
   引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增 时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出现假阳 性.需重新设计引物.
   靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外.②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或 器材均应高压消毒.所用离心管及样进枪头等均应一次性使用.③必要时,在加标本 前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸.二是空气中的小片段核酸污 染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性.可互相拼接,与引物互补后,可扩 增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除.
4、出现非特异性扩增带
    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带.非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关.其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有：①必要时重新设计引 物.②减低酶量或调换另一来源的酶.③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数.④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸).
5、出现片状拖带或涂抹带
     PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带.其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起.其对策有：①减少酶量,或调换另一来源的酶.②减少dNTP的浓度.③适当降低Mg2+浓 度.④增加模板量,减少循环次数.


PCR反应体系与反应条件：
标准的PCR反应体系：
　　　10×扩增缓冲液 　 10ul
　　　4种dNTP混合物 各200umol/L
　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　
　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　
　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　
　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
　　　加双或三蒸水至 　 100ul
PCR反应五要素：
    参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：
    引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可   将模板DNA在体外大量扩增.
     设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp,常用为20bp左右.
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段.
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带.
⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处.
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性.
引物量：
     每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会.
酶及其浓度：　
    目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少.
dNTP的质量与浓度：　
    dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性.dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5,小量分装, -20℃冰冻保存.多次冻融会使dNTP降解.在PCR反应中,dNTP应为50～200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的产量.dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低.
模板(靶基因)核酸：
    模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本. SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接 用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
Mg2+浓度：
    Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜.Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少.


PCR反应条件的选择：
     PCR反应条件为温度、时间和循环次数.
温度与时间的设置：
    基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).
①变性温度与时间：
    变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则 需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败.
②退火(复性)温度与时间：
     退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长 度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合.
③延伸温度与时间：
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　高于90℃时, DNA合成几乎不能进行.、
     PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些.