酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA):是酶免疫测定技术中应用最广的技术.其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 )表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除.常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体.
    根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C－ELISA).在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA.

1、间接ELISA
    本法主要用于检测抗体.以鸭病毒性肝炎(DVH)抗体的ELISA为例,间接ELISA的操作程序如下:
(1)材料
 ① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;
 ② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清;待检鸭血清;
 ③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板.
(2)方法步骤
 ① 加抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
 ② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
 ③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
 ④ 加底物液 → 37℃ 30分钟,加终止液
 ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值,并计算出P/N比值.
(3)结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知阳性血清的OD值≥0.4;在上述条件成立的情况下,如果待检血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待检血清的OD值≥0.4,则判为阳性,否则判为阴性.

2、双抗体夹心ELISA
    本法主要用于检测大分子抗原.现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序.
 ① 加抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
 ② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
 ③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
 ④ 加底物液 → 37℃ 15分钟,加终止液
 ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值.

3、双夹心ELISA
    此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于:它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原,它不仅不必标记每一种抗体,还可提高试验的敏感性.
    此法的基本程序为:
 ① 加抗体(Ab-1)包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
 ② 加待检抗原(Ag)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(Ab-2)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ④ 加入酶标抗Ab-2抗体(AB-3)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
 ⑥ 用ELISA检测仪测定OD值.

4、竞争ELISA
    此法主要用于测定小分子抗原及半抗原,其原理类似于放射免疫测定.
    其基本程序为:
 ① 抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
 ② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ③ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
 ④ 用ELISA检测仪测定OD值.
    被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定,如果待检溶液中抗原越多,被结合的标记抗原的量就越少,有色产物就减少,这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量.此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测;其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记,而且因为抗原的结构不同,还需应用不同的结合方法.此外,试验中应用酶标抗原的量较多.


5、阻断ELISA
    本法主要用于检测型特异性抗体.该方法现已成为猪传染性胃肠炎(TGE)、猪伪狂犬病(PR)及猪胸膜肺炎(AP)的主要检测方法.
    下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序:
 ① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
 ② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
 ⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
 ⑦ 用ELISA检测仪测定OD值.
    本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照.

6、抗体捕捉ELISA
    本法主要用于检测IgM抗体.由于IgM抗体出现于感染早期,所以检测出IgM,则可作为某种疾病的早期诊断.抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种,其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性,该方法的主要程序为:
 ① 用抗u链(抗IgM重链)抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜,洗涤三次、抛干
 ② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
 ③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
 ④ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
 ⑤ 用ELISA检测仪测定OD值.

7、斑点ELISA(Dot-ELISA)
    与常规的微量板ELISA比较,Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点,而且结果可长期保存;但其也有不足,主要是在结果判定上比较主观,特异性不够高等.该方法的主要操作程序为:
(1)载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后,稍加干燥进行压圈.将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中,置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥.每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品,每个压圈可加抗原液1－20μl.
(2)封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中,37℃感作15－30分钟.封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS.
(3)加被检血清 可直接在抗原圈上加,也可剪下抗原圈、置于微量板孔中,再加入一定量适度稀释的待检血清,37℃反应一定时间,用洗涤液洗三次,每次1－3分钟.洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液.
(4)加酶标抗体,37℃反应一定时间后,用洗涤液洗三次.
(5)显色 加入新鲜配制的底物液,37℃反应一定时间后,去掉底物液,加蒸馏水洗涤终止反应.
(6)结果判定 以阳性、阴险血清作为对照,膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应,否则为阴性反应.

8、布ELISA(C－ELISA)
    C－ELISA(Cloth-ELISA)是加拿大学者Blais, B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术.该方法是以疏水性聚脂布(Hydrophobic Polyester Cloth)即涤纶布为固相载体,这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大,可为免疫反应提供较大的表面积,提高反应的敏感性,且容易洗涤,不需特殊仪器等优点.其基本原理与Dot-ELISA类似,只是载体不同.以对布氏杆菌抗原的检测为例,C－ELISA的主要程序为:
(1)首先把抗布氏杆菌的血清包被(吸附)在聚脂布上,并经洗涤及封闭;
(2)加被检样品并于室温下感作30分钟,然后洗5次;
(3)加酶标记的抗布氏杆菌抗体,于室温下感作30分钟,然后洗涤5次;
(4)加入底物液显色;
(5)测定OD值.

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