目的要求：
1、学习链孢霉培养基配制及菌种培养方法.
2、了解链孢霉杂交方法.
3、掌握有关四分子遗传学分析及其基因与着丝粒距离的计算和作图方法.

实验原理：
    链孢霉(Neurospora crassa)属真菌类,染色体为单倍体,繁殖方式可以是有性繁殖,也可以是无性繁殖.无性繁殖是由营养体菌丝或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体,并产生大量的分生孢子.如果把两个不同品系链孢霉接种到杂交培养基上,链孢霉又能进行有性生殖.在有性生殖时,菌丝体顶端的分生孢子基部先长出一个原子囊果,类似高等植物的性器官.原子囊果能够接受来自不同品系菌丝体上的分生孢子,使原来n倍的原子囊果就变成了2n的子囊果.这个2倍体的合子经过减数分裂形成4个子细胞,每个子细胞又经过一次有丝分裂,使原来的4个细胞变成8个细胞,这8个细胞进一步发育成8个子囊孢子并排列在一个子囊中.它们是一次减数分裂和一次有丝分裂的产物.
    链孢霉有性杂交试验是选用了性状不同的两个品系,即子囊孢子的颜色或黑或白,这是由一对等位基因控制的一对相对性状. 如果这两个不同品系链孢霉的孢子通过杂交结合,其后代子囊中产生的8个子囊孢子应该是4黑4白.但是,由于减数分裂中同源染色体的非姊妹染色体之间可以发生交换,结果可能导致其后代子囊孢子4黑4白排列顺序的改变.减数分裂同源染色体配对时, 4条染色单体间发生交换的概率是相同的,所以, 8个子囊孢子会有4种可能的排列顺序,统称之为交换型.另外,没有交换的属于亲组合型,或称非交换型,共有2种排列顺序.因此,在显微镜下可以直接观察到 6种排列顺序.由于链孢霉是单倍体生物,所以,染色体上控制性状的基因是否存在或是否发生过交换,可以直接在子代性状中表现出来.
    由于链孢霉的染色体均为端部着丝点染色体,所以,如果基因位点距离着丝点越远,发生交换的机会就越多,其交换值就越大.因此,可以根据杂交后代中交换型子囊数量与非交换型子囊数量的比例关系,就可以计算出该基因位点与着丝点之间的距离,并且,绘制出基因连锁图.

实验材料：
(1)野生型粗糙链孢霉(Neurospora crassa, n=7),自身可以合成赖氨酸,用lys+表示.子囊孢子是黑色的.
(2)赖氨酸缺陷型粗糙链孢霉,自身失去合成赖氨酸的能力,必须在培养基中添加赖氨酸才能生长,用lys-表示.子囊孢子是白色的.

试剂和器材：
1、试剂：
    琼脂,蔗糖,赖氨酸,玉米粒,次氯酸钠,土豆.
2、器材：
    恒温培养箱,高压灭菌锅,显微镜,解剖针,接种针,试管,载玻片,盖玻片,滤纸片.

操作方法：
1、配制菌种活化培养基：
(1)基本培养基(供lys+活化用)
    土豆去皮洗净切成0.5cm3小块,分别装入试管中,每个试管5～7块.2%的琼脂条和2%蔗糖煮沸溶解后分装在有土豆块的试管中,经121℃高压灭菌15min后,制作成斜面备用.
(2)补充培养基(供lys一活化用)
    在基本培养基中按5mg/100mL量加入赖氨酸,即为补充培养基,其它相同.
(3)杂交培养基
    将玉米粒浸泡24h后洗净,每支试管装3粒.将2%的琼脂条和2%的蔗糖煮沸溶解后,分装含有玉米粒的试管中,经过12l℃,15min高压灭菌,最后,摆放制作成斜面备用.


2、菌种活化：
    从冰箱中取出低温保存的lys+和lys-菌种,在无菌条件下把lys+接种在活化基本培养基上;把接lys-接种在补充培养基上.接种后将试管放在25℃条件下培养5～6天,直至试管中长出许多菌丝,并且有大量的分生孢子产生时表明菌种已经活化成功.
    菌种活化不要时间过长,否则,菌丝和分生孢子老化,影响杂交成功率.
3、杂交与培养：
    将活化的两种菌种(lys+和lys-)同时接种到杂交培养基上,接种菌丝体和分生孢子都可以.然后,在培养基表面放一小块多次折叠的滤纸片,塞上试管棉塞,接种后的试管放25℃恒温培养箱中培养.培养二周后,便有黑色颗粒状子囊果出现,但还没有完全成熟.培养到三周左右时,子囊果基本成熟,可以在显微镜下观察.镜检观察的最佳时间是杂交后第23～25天.
4、显微镜观察与分析：
(1)先在长有子囊果的试管中加入少量无菌水充分摇动,将分生孢子混合在水中.把水倒入烧杯中加热煮沸,防止分生孢子飞扬.
(2)用接种针挑选个大,饱满的子囊果放在载玻片上,滴加一滴5%次氯酸钠溶液浸泡2min左右.次氯酸钠的作用主要是对子囊果壁起腐蚀作用,以便将子囊果压破.压片时用力不宜过大,因为一次分裂产生的8个子囊孢子顺序地排列在一个子囊中,观察时要以子囊为单位进行统计.若用力过大,8个子囊孢子被压出子囊都分散开了,不利于观察.
(3)试验结果的统计与分析
    借助显微镜观察8核子囊中黑,白子囊孢子的排列顺序.根据子囊孢子的6种类型排列顺序进行观察,分类和统计.将观察到的子囊类型和数目填表12中(观察总数不少于100个).应用着丝点作图原理,对统计结果进行计算分析,求得交换值和图距,绘制染色体连锁图.

             表12 链孢霉杂交子囊类型与数量统计表